Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Janina Rau

 

 

 

Induktion fertilisationsassoziierter Reaktionen

bei equinen Spermien in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108416

title (engl.)

Induction of fertilization-associated reactions in equine spermatozoa in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/rauj_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Die In-Vitro-Fertilisation (IVF) wird beim Pferd mit mäßigem Erfolg durchgeführt. Abgesehen von einem Fall in den frühen neunziger Jahren wurde bisher kein durch IVF entstandenes Fohlen geboren. Mit den zur Verfügung stehenden Protokollen zur Vorbereitung der equinen Spermien und Oozyten auf die IVF konnten bisher keine frühembryonalen Stadien erzeugt werden, die sich über das 16-Zellstadium hinaus entwickelten.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Induzierbarkeit der fertilisationsassoziierten Reaktionen Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion bei equinen Spermien in vitro zu untersuchen. In Bezug darauf wurde die Effektivität der Inkubation equiner Spermien in einem Bikarbonat-, Kalzium- und BSA-haltigen modifizierten Whittens-Medium (MW) evaluiert. Zudem wurde untersucht, ob die Induktion der Spermienreaktionen nach Vorinkubation in MW durch die Reagenzien Kalzium-Ionophor A23187 (CaIP) und Procain verstärkt werden kann. Zur Beurteilung der fertilisationsassoziierten Reaktionen wurden mittels computerassistierter Spermienanalyse Motilitätsparameter erfasst, wobei die Geschwindigkeit auf der gebogenen Linie (VCL) und die Amplitude der seitlichen Kopfauslenkung (ALH) der Spermien als Maße für die hyperaktivierte Bewegung herangezogen wurden. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden nach Anfärbung mit spezifischen Farbstoffen der intrazelluläre Kalziumgehalt (Fluo-3) sowie die Plasma- (Propidium-Iodid) und Akrosommembranintegrität (FITC-PNA) als Parameter für die Kapazitation, Viabilität und Akrosomreaktion der Spermien durchflusszytometrisch analysiert. Weiterhin wurde ein heterologer Bindungsassay mit vorinkubierten equinen Spermien und in vitro maturierten porzinen Oozyten durchgeführt. Dafür wurden zunächst eine angemessene Spermienkonzentration und Inkubationszeit für die Koinkubation der Gameten bestimmt. Darauf wurde der Einfluss der Präinkubation equiner Spermien in Magermilchverdünner, Kontroll- und modifiziertem Whittens-Medium sowie die Auswirkungen der Spermienbehandlung mit CaIP und Procain auf die Oozyten-Bindungsfähigkeit der equinen Spermien und auf die Oozytenmorphologie untersucht.

 

Die Kapazitation, Hyperaktivierung und Akrosomreaktion equiner Spermien konnten nach Inkubation für 60–120 min in MW in angefeuchteter Luft bei 37°C induziert werden. Dies war ersichtlich an einer Erhöhung des intrazellulären Kalziumgehaltes, gesteigerten VCL- und ALH-Werten sowie einer Verminderung des Anteils akrosomintakter Spermien. Im Vergleich wurden die fertilisationsassoziierten Reaktionen durch die Inkubation der Spermien in einem Medium ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA nicht induziert.

Die Zugabe von CaIP zu Spermien, die 60 min in MW präinkubiert worden waren, resultierte in einer kapazitationsassoziierten Steigerung des intrazellulären Kalziumgehaltes mit einem Maximum bei einer CaIP-Konzentration von 3 µM. Nach Anwendung eines Zentrifugations-verfahrens zur Reduktion des Kalzium-Ionophorgehaltes in der Spermiensuspension zeigten die Spermien Anzeichen hyperaktivierter Bewegung. Die Zugabe von Procain förderte die Hyperaktivierung deutlich mit einem maximalen Effekt bei einer Konzentration von 2.5–5  mM.

In dem heterologen Bindungsassay konnte gezeigt werden, dass die equinen Spermien in der Lage sind, an in vitro maturierte porzine Oozyten zu binden. Für diesen Versuch wurden 2.5×105 Spermien mit 20 Oozyten für 120 min koinkubiert. Spermien, die vor der Koinkubation eine Behandlung zur Induktion der fertilisationsassoziierten Reaktionen durchlaufen hatten, wiesen unabhängig von einer Reduktion des CaIP- oder Procaingehaltes in den Spermiensuspensionen durch Zentrifugation und Resuspension eine eingeschränkte Bindungsfähigkeit an den Oozyten auf. Die besten Bindungsraten wurden mit Spermien erreicht, die zuvor in Magermilchverdünner präinkubiert worden waren. Nach Koinkubation mit equinen Spermien, die in einem anderen Medium als Magermilchverdünner vorinkubiert worden waren und denen insbesondere CaIP oder Procain zugesetzt wurde, wies ein erhöhter Anteil (bis 8.5%) der porzinen Oozyten morphologische Abweichungen auf.

Unabhängig von der Induktionsbehandlung war eine starke inter- und intraindividuelle Variation sowohl im zeitlichen Verlauf als auch in dem Ausmaß der fertilisationsassoziierten Reaktionen equiner Spermien und ihrer Bindungsfähigkeit an die Zona pellucida porziner Oozyten zu beobachten.

 

Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die fertilisationsassoziierten Reaktionen equiner Spermien in vitro durch Inkubation in modifiziertem Whittens-Medium induziert werden können, nicht aber in einem Medium ohne Bikarbonat, Kalzium und BSA. Auch durch Zugabe von Procain und Kalzium-Ionophor A23187 zu präinkubierten equinen Spermien können die Kapazitation und Hyperaktivierung, nicht aber die Akrosomreaktion induziert werden. Der heterologe Bindungsassay ermöglicht die Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Spermienbehandlungen sowohl auf die Bindungsfähigkeit der Spermien als auch auf die Oozytenmorphologie. Dies kann zur Beurteilung der Fertilisationspotenz equiner Spermien im Hinblick auf die Entwicklung von IVF-Protokollen herangezogen werden.

 

abstract (englisch)

In horses, no great successes have been obtained with in vitro fertilization (IVF). Since the early nineties no foal originating from IVF has been born. With the current protocols for preparing equine spermatozoa and oocytes for IVF, early embryonic development typically arrests before the 16-cell stage.

The aim of this study was to examine induction of the fertilization-associated reactions capacitation, hyperactivation and acrosome reaction in equine sperm in vitro. The efficacy of incubating sperm in modified Whittens medium (MW) containing bicarbonate, calcium and BSA was evaluated. Special emphasis was on effects of addition of calcium ionophore A23187 (CaIP) and procaine after pre-incubation of sperm in MW, to further induce fertilization-associated reactions in sperm. In order to study fertilization-associated reactions computer assisted sperm analysis was used for determining sperm motility characteristics, including the curved line velocity (VCL) and amplitude of lateral head displacement (ALH) related to hyperactivated motility. Using specific dyes and flow cytometry the intracellular calcium content of sperm (fluo-3) as well as plasma (propidium-iodide) and acrosomal membrane integrity (FITC-PNA) were determined as indicators for sperm capacitation, viability and the acrosome reaction. Furthermore, a heterologous sperm-zona-binding assay was performed, using induced equine spermatozoa and in vitro matured porcine oocytes. First, a suitable sperm concentration and incubation time for co-incubation studies were determined. Then, effects of pre-incubating sperm in skim milk extender, control or MW and effects of CaIP and procaine treatment were determined on the number of sperm bound per oocyte and oocyte morphology.

 

Incubation in MW in humidified air at 37°C resulted in initiation of stallion sperm capacitation, hyperactivated motility and the acrosome reaction in vitro within 60–120 min. This was evident as an increase in the intracellular calcium content, increased VCL and ALH values and a decrease in acrosomal membrane intactness, respectively. Incubation in medium lacking bicarbonate, calcium and BSA did not result in initiation of fertilization-associated reactions.

Addition of CaIP after pre-incubating sperm for 60 min in MW resulted in an additional increase in the intracellular calcium content associated with sperm capacitation, exhibiting a maximum when using a concentration of 3 µM. Sperm exhibited signs of hyperactivation after subsequent removal of CaIP by centrifugation. Addition of procain induced a higher level of hyperactivation, exhibiting a maximum effect when adding 2.5−5 mM.

In a heterologous sperm-zona binding assay equine sperm were able to bind in vitro matured porcine oocytes. For these assays 2.5×105 sperm were coincubated with 20 oocytes for 120 min. Sperm treated for induction of fertilization-associated reactions prior to coincubation showed poor binding to oocytes, irrespective of removal of CaIP or procaine via centrifugation. Sperm pre-incubated in skim milk extender prior to binding assays showed the highest rates of binding to oocytes. Increased numbers of oocytes (up to 8.5%) with abnormal morphology were observed after coincubation with sperm treated in medium different from skim milk extender, especially in case of presence of CaIP and procaine.

It was found that there was great inter- and intraindividual variation, both in the timing and extent of fertilization-associated reactions in equine sperm and sperm-zona binding capacity, irrespective of treatment with inducers.

 

In conclusion fertilization-associated reactions in equine sperm can be induced in vitro by incubation in modified Whittens medium, but not in medium lacking BSA, bicarbonate and calcium. The inducers calcium-ionophore A23187 and procaine can be added after pre-incubation to further increase levels of sperm capacitation and hyperactive motility but not the acrosome reaction.

Heterologous sperm-zona-binding assays can be used to study effects of sperm treatments on the oocyte-binding capacity as well as oocyte morphology. This might be helpful for testing fertilization potential of equine sperm with respect to development of IVF protocols.

 

keywords

eguine Spermien, In-Vitro-Fertilisation, Bindungsassay, eguine sperm, in vitro fertilization, binding assay

kb

2.059