Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Sahar El Sayed El Sayed Ali Abd El Rahman

 

Comparative analysis of current infectious bronchitis virus isolates in primary cell culture systems

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-99410

title (ger.)

Vergleichende Analyse von aktuellen Stämmen des infektiösen Bronchitis-Virus in primären Zellkultur-Systemen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2010

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/rahmans_ws10.pdf

abstract (deutsch)

Das aviäre infektiöse Bronchitis-Virus (IBV) ist der Erreger einer hochkontagiösen Erkrankung, welche eine große Bedrohung für die Geflügelindustrie darstellt. Diese Erkrankung wird klinisch durch Manifestationen im Respirationstrakt, in den Nieren und im Legeapparat charakterisiert. Trotz bestehender Impfprogramme spielen Infektionen mit IBV in den Geflügelbständen noch immer eine große Rolle, vor allem durch das Auftreten von neuen Virusvarianten, gegen die die vorhandenen Impfstoffe nicht schützen.

Der Viruseintritt in Wirtszellen wird über die Bindung des viralen Glykoproteins S an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche vermittelt. Die Bedeutung von alpha2,3-gebundenen Sialinsäuren als Rezeptordeterminante ist bereits beschrieben worden. In dieser Arbeit wurde eine vergleichende Studie über die aktuellen Feldisolate 4/91, Italy 02 und QX durchgeführt, um ihre Abhängigkeit von Sialinsäuren in primären Zellkultursystemen zu untersuchen. Um die Hauptzielorgane einer IBV-Infektion im Huhn abzudecken, wurden folgende Gewebekulturen verwendet: a) primäre Hühnerembryo-Nierenzellen, b) Trachealringkulturen, c) Lungen-Präzisionsschnitte und d) Hühner-Legedarm-Explantate. Das Entfernen der Sialinsäuren von der Zelloberfläche durch die Behandlung der Zielzellen mit dem Enzym Neuraminidase, führte dazu, dass alle in die Untersuchung einbezogenen Stämme in ihrer Infektion beeinträchtigt waren. Ein Plaque-Reduktionstest in primären Hühnerembryo-Nierenzellen ergab, dass nach einer Neuraminidase-Behandlung die Anzahl der Plaques bei allen Stämmen vermindert war. Infektionen von Trachealringen durch verschiedene IBV-Stämme verursachen eine Ziliostase, die im Lichtmikroskop deutlich beobachtet werden kann. In Trachealringen, die mit Neuraminidase vorbehandelt wurden, konnte eine verlängerte Zilienaktivität beobachtet werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sialinsäuren eine wichtige Rolle für die Infektion aller untersuchten IBV-Stämme spielen.

Zusätzlich zur Abhängigkeit der Virusinfektion von Sialinsäuren wurden die frühen Zielzellen im Tracheal- bzw. Bronchialepithel identifiziert. Die Immunfluoreszenz-Analyse von infizierten Trachealringen und Lungenschnitten ergab, dass sowohl zilientragende Zellen als auch Becherzellen empfänglich sind für eine Infektion durch alle verwendeten Stämmen. In den Zellen der Parabronchi konnte kein Virusantigen nachgewiesen werden. Eine Färbung der empfänglichen Zellen mit dem Lektin von Maackia amurensis II (MAAII) zum Nachweis alpha2,3-gebundener Sialinsäuren ergab, dass diese Art der Verknüpfung der Sialinsäuren auf den Zielzellen vorherrscht. Interessanterweise waren die Sialinsäuren, die von MAAII detektiert werden können, nach einer Infektion durch die verschiendenen IBV-Isolate auf der Zelloberfläche reduziert. Dies wurde sowohl in der Trachea als auch in den Bronchi beobachtet. Erste Infektionsexperimente in Legedarm-Explantaten von Hühnern zeigen, dass diese Gewebekulturen von IBV infiziert werden können. Eine Lektinfärbung macht deutlich dass alpha2,3-gebundene Sialinsäuren auf den Epithelzellen des Legedarms exprimiert werden. In künftigen Arbeiten soll die Infektion verschiedener Bereiche des Legedarms durch IBV vergleichend untersucht und die Expression von Sialinsäuren genauer analysiert werden.

In dieser Arbeit wurden zwei Kultursysteme für enddifferenzierte Epithelzellen, PCLS und COE, etabliert, die sich bei künftigen Arbeiten als interessante Hilfsmittel erweisen warden, um die Infektion des Respirationstrakts bzw. des Ovidukts durch IBV und andere aviäre Viren zu untersuchen.

 

abstract (englisch)

Avian infectious bronchitis virus (IBV) is the causing agent of a highly contagious disease with a major economic impact on the poultry industry. It is characterised clinically by respiratory, renal and reproductive manifestations. Despite various vaccination protocols, IBV still plays a role in poultry flocks, mostly because of the appearance of new variant strains which are not neutralized by antibodies induced by available vaccines.

Viral entry into host cells is mediated by binding of the viral glycoprotein S to a receptor on the cell surface. Alpha 2,3 linked sialic acid has been reported to play an important role as a receptor determinant for IBV . Here, a comparative study of current field strains, 4/91, Italy 02 and QX has been carried out to investigate their dependence of sialic acid for infection in different primary cell culture systems. To reflect the main target organs of an IBV infection in chicken, the following tissue cultures were used in this study: a) primary chicken embryo kidney cells, b) chicken tracheal organ cell cultures (TOCs), c) chicken precision-cut lung slices (PCLS) and d) chicken oviduct explants (COE).

Removal of sialic acids from the surface of the target cells by treating the cells with the enzyme neuraminidase affected the infection of all analyzed IBV strains. In primary chicken kidney cells, a plaque reduction test revealed that desialylation reduced the number of plaques with all strains. Infection of TOCs by different IBV isolates results in ciliostasis, which can be observed under a light microscope. In TOCs treated with neuramindase prior to infection, a prolonged ciliary activity was observed. These results indicate that sialic acids play an important role for the infection of all analysed IBV strains.

In addition to the dependence of the IBV strains on sialic acid, the primary target cells in the epithelium of trachea and bronchi were identified. Immunofluorescence analysis of infected TOCs and PCLS revealed that ciliated and goblet cells are sensitive to infection by all strains analysed. No viral antigen was detected in cells of the parabronchi. Staining of the sensitive cells with the lectin MAAII, to detect alpha 2,3-linked sialic acids, showed that this linkage type of sialic acid is abundantly expressed on the target cells. Interestingly, the amount of sialic acids on the cell surface detectable by MAAII was reduced after infection by the different IBV strains in the trachea and also in the bronchi.

First infection experiments in chicken oviduct explants show, that these tissue cultures can be infected by IBV and a lectin staining revealed, that alpha2,3-linked sialic acids are expressed on the oviduct epithelial cells. Future work will compare the infection by IBV in different parts of the oviduct and will analyze the expression of sialic acids.

In this study, we have established two culture systems for well-differentiated epithelial cells, PCLS and COE, which promise to be valuable tools in the future to analyse the infection of the respiratory tract and oviduct by IBV and other avian viruses.

 

keywords

Infektiösen Bronchitis-Virus, Sialinsäuren, rimären Zellkultur, infectious bronchitis virus, sialic acid, primary cell culture

kb

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