Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Daniela Ragancokova

 

The role of synaptic transmission in the pathophysiology and therapy

of neurodegenerative disease, amyotrophic lateral sclerosis

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-98068

title (ger.)

Synaptische Übertragung in Pathophysiologie und Therapie der neurodegenerativen Krankheit Amyotrope Lateralsklerose

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ragancokovad_ws09.pdf

abstract (deutsch)

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Vaproat (VPA) eine therapeutische Option bei neurodegenerativen Erkrankungen wie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) darstellt. Da multiple Pathomechanismen zur Entstehung der ALS beitragen, erscheint eine Kombinationstherapie aus unterschiedlichen neuroprotektiven Substanzen mit additiven Effekten als vielversprechende Strategie für zukünftige klinische Studien.

In unseren Untersuchungen konnten wir mittels Immunzytochemie zeigen, dass VPA in hohen Konzentrationen zu vergleichbaren toxischen Effekten (dosisabhängiger Motoneuronverlust) führt wie die Applikation der exzitotoxischen Substanz Kainat. Um potenzielle neuroprotektive Effekte von VPA zu charakterisieren, untersuchten wir zunächst die Interaktion hochaufgereinigter embyronaler Motoneurone in unterschiedlichen Zellkulturbedingungen im Hinblick auf Zellüberleben in Abhängigkeit von der Präsenz ko-kultivierter Schwann-Zellen oder Astrozyten. Die basale Überlebensrate von Motoneuroren nahm signifikant zu, wenn diese auf glialen Zellen kultiviert wurden, zudem erbrachte die Ko-Kultur mit glialen Zellen zusammen mit der VPA-Applikation auch gewisse protektive Effekte gegen die neurotoxische Wirkung von Kainat. Calcium imaging-Experimente zeigten keinen Einfluss von VPA auf die Kalziumtransienten von Motoneuronen, die bereits das Stadium der Sponatanaktivität erreicht hatten (>10 Tage in Kultur). In den ersten 10 Tagen, in denen noch keine Spontanaktivität nachweisbar war, wurden die Kainat-induzierten spontanen Kalziumtrasienten in Anwesenheit von VPA jedoch signifikant gesteigert. Um das Problem toxischer Nebenwirkungen von hochdosiertem VPA zu umgehen, wurden in den letzten Jahren eine Anzahl chemischer VPA-Derivate synthetisiert. Wir untersuchten drei vor kurzem entwickelte Substanzen: 3-propyl-heptanoic acid (3-PHA) und die PE-4-yn-Enantiomere (R- and S- PE-4-yn) bezüglicher ihrer neuroprotektiven Effekte. Bei simultaner Inkubation von Motoneuronen mit Kainat und VPA oder den unsersuchten VPA-Derivaten ergaben sich keine signifikanten Effekte auf das Zellüberleben. Präinkubation der Zellen mit VPA und den Derivativen vor der Kainat-Applikation führte jedoch zu signifikanter Reduktion der Zellvulnerabilität. Die höchste Steigerung des Zellüberlebens wurde nach Präinkubation mit S-PE-4-yn beobachtet. Mittels der Patch Clamp-Technik untersuchten wir die Hypothese einer Korrelation zwischen neuroprotektivem Effekt und einer Modulation der synaptischen Aktivität. Die Analyse spontaner synaptischer Aktivität in unbehandelten im Vergleich zu mit den Testsubstanzen inkubierten Motoneuronen in Ko-Kultur mit glialen Zellen ergab eine Veränderung in Richtung vermehrter transsynaptischer Inhibition. Das VPA-Derivat  S-PE-4-yn reduzierte die Frequenz, aber nicht die Amplitude von sowohl exzitatorischen als auch inhibitorischen postsynaptischen Potenzialen, wiederum jedoch nur, wenn die Motoneurone auf glialen Zellen kultiviert wurden.

Weitere Studien sind erforderlich, um die exakten Wirkmechanismen von VPA und den hier untersuchten Derivaten zu identifizieren, die den beobachteten neuroprotektiven Effekten zugrunde liegen.

 

abstract (englisch)

In summary our results indicate that VPA might be applicable to neurodegenerative diseases such as ALS. As multiple mechanism have been shown to be involved in ALS pathogenesis, a combination of several neuroprotective compounds with additive effects appears might be a promising strategy for future clinical trials.

In our studies we proved that high concentrations of VPA, however, as well as KA application alone, led to dose-dependent loss of motor neurons as was shown by immunocytochemistry. In order to address a potential neuroprotective role of VPA in motor neurons, we first studied the interactions of highly purified populations of developing neurons under different culture conditions regarding cell survival and its dependency on glial feeding co-cultures, i.e. astrocytes or Schwann cells. Glial feeder layers significantly enhanced basal survival of motor neurons, and slightly protected them against KA neurotoxicity in presence of VPA. Calcium imaging experiments revealed no effect of VPA on calcium transients once motor neurons were spontaneously active (>10 days in culture). In non-spontaneously active motor neurons (<10 days in culture), however, KA induced intracellular calcium transients were significantly increased in presence of VPA. To overcome the problem of adverse effects of VPA administered in higher dosages, a number of chemical derivates of VPA have been synthesized. We focus on three out of a number of synthesized VPA derivates that have lately been under investigation: 3-propyl-heptanoic acid (3-PHA) and PE-4-yn enantiomers (R- and S- PE-4-yn). The survival of motor neurons under simultaneous application of KA and VPA derivates was not significantly increased.  Pre-incubation of the cells with VPA and even more with the derivates before the addition of KA, however, significantly reduced their vulnerability against the KA-induced neurotoxic effect. The highest increase in motoneuron survival was seen after pre-incubation with S-PE-4-yn. We additionally tested the hypothesis of a correlation of the modulation of synaptic activity and a neuroprotective effect on motoneurons using whole cell patch clamp technique. The analysis of spontaneous synaptic activity in untreated cells and in presence of the test-compounds on glial feeder layers revealed a shift towards increased transsynaptic inhibition. VPA derivate, S-PE-4-yn reduced the frequency but not the amplitute of both spontaneous excitatory (EPSCs) and inhibitory (IPSCs) postsynaptic currents in motoneurons cultured on glial feeder layers.

Clearly, further studies are necessary to identify the exact mechanism of action of VPA and its derivates that are involved in beneficial action of potential neuroprotective effect.

 

keywords

Motoneurone, Valproicsäure, Excitotoxizität; Motoneurons, Valproic acid, excitotoxicity

kb

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