Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Friederike Poppicht

Bedeutung des Insulin-like growth factor - Systems

während der Oozytenreifung und

präimplantorischen Embryonalentwicklung

des Rindes

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106766

title (engl.)

Relevance of the Insulin-like growth factor system during oocyte maturation and preimplantation embryonic development in cattle

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/poppichtf_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mehr über die Funktion des Insulin-like growth factor 1 und im Speziellen bei der Verhinderung von Apoptose während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes zu erfahren. Dies wurde zum einen durch die Analyse der Expression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene in bovinen Embryonen ermittelt. Zum anderen wurde der Einfluss einer IGF1 - Supplementation des Mediums während der In-vitro-Reifung boviner Eizellen auf die morphologische und molekulare Qualität der resultierenden Embryonen untersucht. Dazu konnten in 121 IVP-Durchgängen insgesamt 12.872 Kumulus-Oozyten-Komplexe gewonnen, befruchtet und kultiviert werden. Zur Untersuchung der Expression des IGF1R wurde eine RT-qPCR mit frühen Embryonalstadien vom 2-Zeller bis zur expandierten Blastozyste durchgeführt. Weiterhin fanden ein Western blot und eine Immunfluoreszenzfärbung Anwendung, um das IGF1R-Protein in diesen Stadien zu analysieren. Für die Supplementationsversuche kam eine physiologische (100 ng/ml) oder eine supraphysiologische Konzentration (1000 ng/ml) IGF1 zum Einsatz, die entweder allein oder gemeinsam mit den Apoptoseinduzierern Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin dem Maturationsmedium supplementiert wurde. Die Inkubation einer weiteren Gruppe KOK erfolgte in Medium mit Apoptoseinduzierern allein. Als Kontrollgruppe diente sowohl eine Gruppe, dessen Medium den Lösungsvermittler DMSO enthielt, als auch eine Gruppe, die ohne jeglichen Zusatz inkubiert wurde. Auf morphologischer Ebene fand eine Untersuchung der Maturationsrate, der Teilungs- und Entwicklungsrate, der Gesamtzellzahl, der Anzahl toter Zellen, der Lebend-Tot-Zellratio und der Anzahl apoptotischer Zellen statt. Des Weiteren wurde auf molekularer Ebene die Expression von sieben ausgewählten Genen in expandierten Blastozysten analysiert (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, BCL2L1, SLC2A1, SLC2A3). Als Ergebnisse aus den Untersuchungen lassen sich folgende Erkenntnisse festhalten:

1.         Die durchschnittliche Kernreifungsrate von Eizellen der Kontrollgruppe (83,5 ± 6,9 %) war signifikant höher als in Eizellen, denen IGF1 (1000 ng/ml) zugesetzt wurde (70,2 ± 6,0 %). Außerdem war in Eizellen, die mit Apoptoseinduzierern allein oder zusammen mit IGF1 kultiviert wurden, die Maturationsrate signifikant reduziert (P ≤ 0,05).

2.         Es konnte eine durchschnittliche Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % in Embryonen der Kontrollgruppe und 62,2 ± 8,4 % in denen der DMSO-Gruppe erzielt werden, die signifikant höher lagen als in der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (52,7 ± 6,9 %; P ≤ 0,05).

3.         Die Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung wiesen ebenfalls statistisch signifikante Unterschiede auf (P ≤ 0,05). So zeigte sich an Tag sieben eine signifikant höhere Entwicklungsrate in Embryonen der Kontrollgruppe (22,1 ± 6,4 %) im Vergleich zu Embryonen der Gruppen IGF 100 mit Apoptoseinduzierern (13,5 ± 7,4 %), IGF 1000 (13,6 ± 6,2 %) und IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (7,9 ± 4,7 %). An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der Kontrollgruppe (24,1 ± 8,5 %) erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern (15,4 ± 8,2 % bzw. 10,0 ± 4,8 %).

4.         Die Untersuchung der Gesamtzellzahl ergab einen Durchschnitt von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste in der Kontrollgruppe, die im Vergleich zu Blastozysten der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (110,7 ± 20,3) signifikant höher ausfiel (P ≤ 0,05). Allerdings konnten keine Unterschiede in der Anzahl toter Zellen zwischen Blastozysten der Versuchsgruppen beobachtet werden. Bei der Gegenüberstellung der Lebend-Tot-Zellratio konnte jedoch eine signifikant größere Ratio in Blastozysten der Kontrollgruppe (19,1 ± 6,8) gegenüber denen der Gruppen DMSO (11,2 ± 4,7), Apoptoseinduzierer (11,4 ± 5,6), IGF 100 (10,2 ± 5,1) und IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (8,8 ± 3,1) erkannt werden.

5.         Bei der Untersuchung von Apoptose in Embryonen wurden in der Kontrollgruppe durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste detektiert. Die Embryonen, die aus einer Maturation mit Apoptoseinduzierern stammten, wiesen im Vergleich dazu eine signifikant höhere prozentuale Anzahl apoptotischer Zellen auf (3,6 ± 1,9 %; P ≤ 0,05).

6.         Die Analyse der relativen Transkriptmenge ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede für die Gene IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, SLC2A1 und SLC2A3. Die Expression von BCL2L1 war in Embryonen der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen der anderen Gruppen signifikant erhöht (P ≤ 0,05).

7.         Die Messung der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe verschiedener kommerzieller Kits führte nicht zu einem eindeutigen Ergebnis. In allen Supplementationsgruppen wurden ähnliche Werte gemessen, die nicht der hinzugegebenen Konzentration IGF1 entsprachen.

8.         Die Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R in frühen Embryonalstadien zeigte ein stadienspezifisches Muster, welches die Vorgänge der maternal-embryonic transition widerspiegelt. Zu Beginn der ersten Furchungsteilungen konnte die größte, relative Transkriptmenge aufgezeigt werden, woraufhin ein Abfall bis zum 8-Zellstadium verzeichnet wurde. Vom 16-Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der Expression registriert werden.

9.         Ein qualitativer Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins war mit der Western blot - Methode in expandierten Blastozysten möglich. Allerdings wurde aufgrund der geringen Signalstärke keine Quantifizierung des Proteingehaltes durchgeführt.

10.     Bei der Analyse des IGF1R mit einer Immunfluoreszenzfärbung in frühen Stadien der Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden. Dies zeichnete sich durch ein Maximum während des 2- und 4-Zellstadiums aus, woraufhin eine signifikante Abnahme bis zum 16-Zeller folgte. Vom Stadium der Morula bis hin zur expandierten Blastozyste wurde ein erneuter Anstieg der Proteinexpression des IGF1R gezeigt.

11.     Der Vergleich der spezifischen Expression des IGF1R auf mRNA- und Proteinlevel zeigte ein ähnliches Muster, welches mit Vorgängen der maternal-embryonic transition einhergeht und die Bedeutung des IGF-Systems während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes hervorhebt.

Schlussfolgernd kann daher zusammengefasst werden, dass IGF1 während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung eine entscheidende Rolle spielt, was durch die stadienspezifische Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene bestätigt wurde. Jedoch konnte eine Verhinderung von Apoptose durch IGF1 im bovinen Embryo nicht beobachtet werden. Weiterhin kam es nicht zu einer Verbesserung der Embryonenqualität durch den Zusatz einer physiologischen Konzentration IGF1 während der Eizellreifung. Abschließend führte eine erhöhte Konzentration IGF1, wie sie während der negativen Energiebilanz bei Milchrindern während der Transitionsphase auftritt, zu einer negativen Beeinflussung der Qualität boviner Embryonen.

abstract (englisch)

The aim of the present study was to evaluate the function of the Insulin-like growth factor 1 and specifically on apoptosis inhibition during preimplantation embryonic development in cattle. On the one hand, this was investigated by analyzing the expression of the insulin-like growth factor 1 receptor in bovine embryos at mRNA and protein level. On the other hand, the influence of an IGF1 medium supplementation during in vitro maturation of bovine oocytes was studied regarding the morphological and molecular quality of the resulting embryos. Therefore, in a total of 121 IVP runs 12.872 cumulus oocyte complexes were collected, matured, fertilized and cultured. To analyze the IGF1R expression a RT-qPCR of early embryonic stages from the 2-cell until the expanded blastocyst was performed. Further on, a western blot and an immunofluorescence staining were used to investigate the IGF1R protein. For the supplementation experiments a physiological (100 ng/ml) or a supraphysiological concentration (1000 ng/ml) IGF1 were added either alone or in combination with the apoptosis inducers actinomycin D and S-(+)-camptothecin zo the IVM medium. Another group of COC was incubated only with apoptosis inducers. DMSO alone in the maturation medium and medium without any supplements served as controls. At morphological level the maturation rate, the cleavage and developmental rates, the total cell number, the amount of dead cells, the live-dead cell ratio and the number of apoptotic cells were analyzed. Furthermore, at molecular level the expression of seven selected genes was examined in expanded blastocysts (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, BCL2L1, SLC2A1, SLC2A3). The following results were obtained:

1.              The average maturation rate of control group oocytes (83.5 ± 6.9 %) was significantly higher compared to oocytes originating from IGF1 (1000 ng/ml) supplementation (70.2 ± 6.0 %). Moreover oocytes stemming from a culture with apoptosis inducers alone or together with IGF1 showed significant lower maturation rates (P ≤ 0.05).

2.              An average cleavage rate of 60.6 ± 8.1 % in control group embryos and 62.2 ± 8.4 % in embryos of the DMSO group were achieved, which were significantly higher as in embryos of the group IGF 1000 with apoptosis inducers (52.7 ± 6.9; P ≤ 0.05).

3.              Developmental rates at day seven and eight of culture showed statistical differences as well. At day seven, a significant higher developmental rate was detected in embryos of the control group (22.1 ± 6.4 %) in contrast to embryos of the group IGF 100 with apoptosis inducers (13.5 ± 7.4 %), IGF 1000 (13.6 ± 6.2 %) and IGF 1000 with apoptosis inducers (7.9 ± 4.7 %; P ≤ 0.05). At day eight of culture, a significant higher developmental rate was obtained in control group embryos (24.1 ± 8.5 %) compared to embryos of the IGF1 with apoptosis inducers group (15.4 ± 8.2 % resp. 10.0 ± 4.8 %).

4.              On average, 134.9 ± 18.6 cells per blastocyst were counted in embryos of the control group, which was significantly higher compared to blastocysts of the group IGF 1000 with apoptosis inducers (110.7 ± 20.3; P ≤ 0.05). Although there were no differences in the number of dead cells between blastocysts of the different treatments, the comparison of live-dead cell ratio resulted in a significant higher ratio in blastocysts of the control group (19.1 ± 6.8) to blastocysts from DMSO (11.2 ± 4.7), apoptosis inducers (11.4 ± 5.6), IGF 100 (10.2 ± 5.1) and IGF 1000 with apoptosis inducers (8.8 ± 3.1).

5.              The analysis of apoptosis in embryos led to an average number of 2.1 ± 1.1 % TUNEL-positive cells per control group blastocyst. In contrast to that, embryos stemming from a maturation with apoptosis inducers showed a significant higher percentage of TUNEL-positive cells (4.5 ± 2.1; P ≤ 0.05).

6.              No significant differences in the expression of IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, SLC2A1 and SLC2A3 could be detected in embryos of the different treatments. The relative transcript abundance of the BCL2L1 gene was significantly increased in embryos of the group IGF 1000 with apoptosis inducers in comparison with embryos of all other groups.

7.              The measurement of the IGF1 concentration in media by different commercial kits did not lead to a distinct result. Medium from all groups of supplementation showed similar IGF1 concentrations, which were not consistent with the supplemented amount of IGF1.

8.              The analysis of the IGF1R mRNA expression in early embryonic stages showed a stage-specific pattern, which reflects the process of the maternal-embryonic transition. At the beginning of the first cleavages the highest relative transcript amounts could be detected. Thereupon, an expression decline until the 8-cell stage was measured. From the 16-cell stage to the expanded blastocyst a continuous increase of the relative transcript abundance was observed.

9.              A qualitative detection of the IGF1 receptor protein was possible in expanded blastocysts employing a western blot. However, due to the weak signal strength a quantification of the protein amount could not be performed.

10.          A stage-specific expression of the IGF1R protein was detected in early stages of embryonic development with immunofluorescence staining. This was characterized by a maximum at the 2- to 4-cell stage, whereupon a significant decrease until the 16-cell stage pursued. From the morula to the expanded blastocyst a rise of the IGF1R protein expression could be observed.

11.          The comparison of the specific IGF1R expression at the mRNA and protein level showed similar patterns, which accompany the process of the maternal-embryonic transition and emphasize the importance of the IGF system during early embryonic development.

In conclusion, IGF1 plays an important role during preimplantation embryonic development, which was confirmed by a stage-specific expression at the mRNA, as well as at the protein level. However, a prevention of apoptosis by IGF1 in bovine embryos could not be observed. Furthermore, no improvement of embryo quality due to a physiological concentration of IGF1 during oocyte maturation could be achieved. Finally, a higher concentration of IGF1 as seen during the negative energy balance in high yielding dairy cows seems to have a negative influence of bovine embryo quality.

 

keywords

Insulin-like growth Faktor, Oozytenreifung, Embryonalentwicklung, insulin-like growth factor, oocyte maturation, embryonic development

kb

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