Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Grzegorz Podrygajlo

 

Differentiation of human teratocarcinoma cell line into motor neurons: investigation of cellular phenotype in vitro and in transplantation studies

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-98054

title (ger.)

Differenzierung der menschlichen Teratokarzinoma Zellinie in Motoneuronen : Charakterisierung des zellulären Phänotyps in vitro und in Transplantationsstudien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/podrygajlog_ws09.pdf

abstract (deutsch)

Das Ziel dieses Projekte war die Entwicklung von Zellkultur-Techniken für die gerichtete Differenzierung der menschlichen Zelllinie Teratocarcinoma (Ntera-2) in postmitotische Motoneuronen. Immunzytochemische und elektrophysiologischen Methoden wurden zur Charakterisierung der zellulären Eigenschaften der differenzierten Neuronen in vitro benutzen. Zur Untersuchung von  Integration, Differenzierung und Reifung der NT2 Zellen in einem in-vivo-System, wurden sie in das Nervensystem von Hühner Embryonen transplantiert.
Nach der Behandlung mit RA und der Proliferation in Zellaggregaten wurden NT2 Vorläufer-Zellen innerhalb eines Monats in postmitotische Neuronen (NT2N) differenziert. NT2N neuronale Zellen zeigten Morphologie und Immunoreaktivität gegen einer Reihe von neuronalen Markern einschließlich Zytoskelett Proteine wie β-III-Tubulin, Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 und phosphoryliertes Tau. Darüber hinaus zeigen neuronale Fortsätze punktförmige Immunoreaktivität gegen Synapsin und Synaptotagmin. Mit der outside-out-Patch-Clamp-Konfiguration wurde die Kinetik der Ströme nach einer schnellen Badapplikation der Aminosäure Neurotransmitter GABA und Glutamat gemessen. Spontane postsynaptischen Ströme konnten in gliafreien Zellkulturen nachgewiesen werden. Die spontanen postsynaptische Ströme sind ein Indikator für die Bildung funktionaller Synapsen.  Differenzierte NT2 Neuronen bestehen in Zellkultur aus eine heterogenen Population, die Immunreaktivität gegen glutamaterge Marker, Serotonin, Gamma-Amino-Buttersäure, und sein Synthese-Enzym Glutaminsäure-Decarboxylase exprimiert. Subpopulationen synthetisieren nach  Applikation von NO-Donoren cGMP. Ein großer Teil zeigt Immunoreakivität gegen den cholinergen Marker Cholin Acetyl-Transferase (ChAT), vesikulären Acetylcholin-Transporter und die nonphosphorylated Form des Neurofilament H. Dieses ist charakteristisch für Motoneuronen. In Co-Kulturen von NT2 Neuronen mit den Maus Myotuben wurden morphologische Strukturen gefunden, die neuromuskuläre Synapsen ähneln. Diese Strukturen sind immunreaktiv gegen ChAT, Synapsin und binden α-Bungarotoxin. Humane NT2 Neuronen wurden bereits von vielen Arbeitsgruppen erfolgreich in das Nervensystem erwachsener Tiere und einer begrenzten Anzahl von neurologischen Patienten transplantiert. Ich habe zum ersten Mal eine Studie über die Integration und Differenzierung der verschiedenen NT2 Zellen in der lokalen Umgebung des Hühner Embryo durchgeführt. Dazu wurden NT2 Vorläuferzellen (NT2), NT2 vorbehandelt mit Retinsäure (NT2 + RA), NT2 vorbehandelt mit Retinsäure und Sonic Hedgehog (NT2 + RA + SHH) und NT2-Neuronen (NT2N) in das Rückenmark und Gehirn transplantiert. Die Integration, Differenzierung und Neuritenwachstum der transplantierten Zellen wurde nach 3 - 5 Tage Inkubationzeit durch eine morphologische Analyse und Färbung gegen β-III-Tubulin verfolgt. Das Rückenmark scheint für das Neuritenwachstum permissiver als das Gehirn zu sein. Oftmals verlaufen die Neuriten der Transplantate im Rückenmark in Richtung zu den ventralen Wurzeln. Diese Morphologie ähnelt motoneuronalen Projektionen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in den Hühnerembryo transplantierte NT2 Neuronen und vorbehandelte NT2 Zellen als ein einzigartiges Modell für die in-vivo-Studie über die menschliche Entwicklung neuronaler Zellen dienen können.

 

abstract (englisch)

The aim of this project was to develop cell culture techniques for the directed differentiation of the human teratocarcinoma cell line (Ntera-2) into postmitotic motoneurons. Immunocytochemical and electrophysiological methods were used to characterize the cellular properties of the differentiated neurons in vitro. To investigate integration, differentiation and maturation of the NT2 cells in an in vivo system, they have been transplanted into the nervous system of chick embryos.

Upon treatment with RA, and a proliferation step in free-floating cell aggregates, NT2 precursor cells can be induced to differentiate into postmitotic neurons (NT2N) within one month. NT2N cells showed neuronal morphology and immunoreactivity to a number of neuronal markers including cytoskeletal proteins such as β- III-tubulin, microtubule-associated protein 2, and phosphorylated tau. Moreover, neural processes displayed a punctate immunoreactivity for synapsin and synaptotagmin. Using the outside-out patch-clamp configuration, the kinetics of currents elicited by a rapid application of the amino acid neurotransmitters glutamate and GABA were measured. Spontaneous postsynaptic currents could be detected in glia free cell cultures, indicating the formation of functional synapses.

Differentiated NT2 neurons when cultured in vitro, are a heterogeneous population displaying glutamatergic markers, serotonin, gamma-amino-butyric acid, and its synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase immunoreactivity. Subpopulations respond to the application of nitric oxide donors with the synthesis of cGMP. A major subset shows immunoreactivity to the cholinergic markers choline acetyl-transferase (ChAT), vesicular acetylcholine transporter and the nonphosphorylated form of neurofilament H, all indicative of motor neurons. In co-cultures of NT2 neurons with mouse myotubes, morphological structures resembling neuromuscular junctions were found that stain for ChAT, synapsin and α-bungarotoxin.

Human NT2 neurons have been successfully transplanted by many groups into the nervous tissue of adult experimental animals and a limited number of human neurological patients. For the first time, a study of integration and differentiation of various NT2 cells in the cells in the environment of the chick embryo was conducted. I have injected NT2 precursor cells (NT2), NT2 pretreated with retinoic acid (NT2+RA), NT2 pretreated with retinoic acid and Sonic hedgehog (NT2+RA+Shh), and NT2 neurons (NT2N) into the spinal cord and brain. Monitoring of integration, differentiation and outgrowth ratio between transplanted cell types was done after 3-5 days of incubation by morphological analysis and staining for β-III-tubulin. The spinal cord appears to facilitated neurite extension more than the brain. In addition, extending neurites of spinal grafts were often approaching the ventral roots, thus resembling motoneuronal projections. In summary, NT2 neurons and pretreated NT2 cells transplanted into chick embryos, may serve as a unique model for the in vivo study of human neuronal cells development.

 

keywords

NT2, Motoneuron, Retinsaeure, NT2, motoneuron, retinoic acid

kb

2.374