Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Vanessa Maria Pfankuche

Comparative investigations of different in situ hybridization methods and detection of novel viral agents causing central nervous system diseases

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111450

titel (deu.)

Vergleichende Untersuchungen verschiedener in situ-Hybridisierungs-Methoden und Nachweis neuartiger, neuropathogener Viren

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/pfankuchev_ss18.pdf

abstract (deutsch)

In situ-Hybridisierung (ISH) stellt eine nützliche Methode zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren in verschiedenen Gewebeproben dar. Die Ziele der vorliegenden Studie sind (i) der Vergleich dreier verschiedener ISH-Methoden in ihrer Effektivität verschiedene Viren zu detektieren und (ii) die Anwendung erhobener Daten zum Nachweis neuartiger sowie neu aufkommender und wieder-aufflammender Krankheitserreger.

Der erste Teil der Arbeit konzentriert sich auf eine vergleichende Studie dreier ISH-Techniken zum Nachweis 8 verschiedener Viren in unterschiedlichen Geweben [5 RNS-Viren: atypisches porzines Pestivirus (APPV) im Kleinhirn von Schweinen, bovines Hepacivirus (BovHepV) in der Leber von Rindern, equines Hepaciviurs (EqHV) in der Leber von Pferden, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) in der Nase von Kamelen, Schmallenberg-Virus (SBV) im Großhirn von Ziegen und 3 DNS-Viren: kanines Bocavirus (CBoV-2) im Darm von Hunden, porzines Bocavirus (PBoV) im Rückenmark von Schweinen und porzines Circovirus 2 (PCV-2) in der Lunge, dem Lungenlymphknoten und dem Großhirn von Schweinen]. Die Vergleichsmethoden umfassen (i) chromogene ISH (CISH) unter Verwendung von selbst entworfenen und synthetisierten Digoxigenin (DIG)-markierten RNS-Sonden unter Verwendung des pCR4-TOPO-Vektors zum Nachweis von RNS- und DNS-Viren, (ii) CISH unter Verwendung von DIG-markierten kommerziell hergestellten RNS- (equines Hepacivirus) oder DNS-Sonden (DNS-Viren) und (iii) fluoreszierende ISH (FISH) unter Verwendung kommerziell erhältlicher RNS-Sonden-Mixe (Thermo Fisher Scientific) zur Detektion von RNS- und DNS-Viren. Die RNS-Sonden-Mixe detektierten 7 von 8 Viren (87,5 %), jedoch waren sie nicht in der Lage MERS-CoV in entkalktem Nasengewebe eines Kamels nachzuweisen. Die selbst entworfenen RNS-Sonden detektierten 50% der getesteten Viren, 2 RNS- und 2 DNS-Viren. Die kommerziell produzierten DNS-Sonden detektierten 66,67% der DNS-Viren, allerdings konnten die EqHV-spezifischen RNS-Sonden das Virus nicht nachweisen. SBV, CBoV-2 und PCV-2 konnten von allen getesteten Sonden nachgewiesen werden. Zur Berechnung der zellassoziierten, positiven Fläche wurden Gesamtflächen des Gewebes pro Objektträger und die zellassoziierten positiven Bereiche gemessen. Aus den Ergebnissen wurde der Prozentsatz der positiven Fläche berechnet. Für CBoV-2 und PCV-2 war die größte positive Fläche unter Verwendung des RNS-Sonden-Mixes zu beobachten. Im Gegensatz dazu, wurde für SBV die größte Fläche im Großhirn einer SBV-positiven Ziege unter Verwendung der anti-sense RNS-Sonde gemessen.

Die Materialkosten, die bei der ISH mittels DIG-markierter Sonden, sowohl selbst entworfener RNS als auch die kommerziell hergestellter RNS- und DNS-Sonden, inklusive Sondensynthese und ISH, entstehen, belaufen sich auf 10,-€ pro Schnitt. Im Gegensatz dazu kostet ein Objektträger mit dem RNS-Sonden-Mix, der eine hohe Sensitivität zeigte, mindestens 60,-€. Die benötigte Zeit wurde nach drei Auswertungskategorien berechnet, (i) die reine Arbeitszeit (ii) die Arbeitszeit einschließlich Inkubationszeiten und (iii) die benötigte Zeit in Tagen beginnend mit der Sonden-, Kit- und Plasmid-Bestellung. In Bezug auf die Arbeitszeit ohne und mit Inkubationszeiten ist der kommerziell erhältliche RNS-Sonden-Mix mit 3 bzw. 13 Stunden das schnellste System. Dies stellt außerdem einen kostensparenden Aspekt dar. Der größte Nachteil dieser Methode sind allerdings lange Bestellzeiten von 21 Tagen. Im Gegensatz dazu dauert eine ISH mit kommerziell produzierten oder selbst gebauten Sonden etwa 10 bzw. 16 Tage.

Abschließend lässt sich sagen, dass die ISH eine sehr hilfreiche Methode für die Entdeckung neuartiger Viren darstellt. Allerdings ist die Wahl, der am besten geeigneten ISH-Technik, sehr fallabhängig, da Faktoren wie Zeit, Kosten und Sensitivität zwischen den verschiedenen Techniken, Viren und Geweben variieren. Allerdings zeigte der RNS-Sonden-Mix im Nachweis der getesteten Viren die höchste Detektionsrate.

Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Nachweis von PBoV im Rückenmark eines Schweins mit Enzephalomyelitis unter Verwendung von next generation sequencing (NGS) und FISH. Dies ist der erste Bericht von PBoV im zentralen Nervensystem (ZNS) von Schweinen. Interessanterweise wurde aus dem Liquor von Menschen mit Enzephalitiden bereits ein humanes Bocavirus isoliert. Die Verwendung von FISH zeigt den Neurotropismus von PBoV, da virale Nukleinsäuren innerhalb des Zytoplasmas und des Zellkerns von Neuronen detektiert wurden. Da die Isolierung von PBoV fehlschlug und die Koch´schen Postulate damit nicht zu erfüllen sind, wurde die FISH verwendet, um eine Korrelation aus Läsion und Virus herzustellen, die deutlich auf die Pathogeniät von PBoV hinweist.

Der dritte Teil beschreibt den Nachweis des felinen Panleukopenie-Virus (FPV) im ZNS einer Katze mit klinischer Ataxie und histologisch nachgewiesenen intraneuronalen Vakuolen. FPV wurde bereits in Neuronen bei Katzen nachgewiesen. Allerdings deutet der in situ-Nachweis viraler Nukleinsäuren und Proteine mittels CISH und Immunhistochemie in vakuolisierten Neuronen, in Gliazellen und in Endothelzellen auf ein neues Manifestationsmuster von FPV bei Katzen hin, da FPV-Infektionen des felinen ZNS meist auf zerebelläre Missbildungen beschränkt sind.

Der vierte Teil befasst sich mit dem Nachweis und der Visualisierung des Batai-Virus im ZNS eines Seehundes mit Meningoenzephalomyelitis unter Verwendung von Virusisolation, NGS und FISH. Virale Nukleinsäuren wurden in verschiedenen ZNS-Arealen, wie dem Großhirn, dem Kleinhirn und dem Rückenmark nachgewiesen. Außerdem wurde Batai-Virus in der Tunica mucosa des Dünndarms und in kortikalen und medullären Lymphozyten des Lungenlymphknotens beobachtet. Eine RT-PCR bestätigte die Ergebnisse, da die höchste Viruslast im ZNS, gefolgt vom Darm gefunden wurde. Eine ISH am ZNS 8 weiterer Seehunde mit ähnlichen histopathologischen Veränderungen verlief mit negativem Ergebnis. Allerdings zeigte ein anderer Seehund desselben Zoos, der 2 Monate zuvor an akutem Nierenversagen verstarb, ein positives Batai-Virus spezifisches Signal in den Glomerula und den renalen Tubulusepithelzellen, in der Tunica mucosa des Dünndarms und in kortikalen und medullären Lymphozyten des Lungenlymphknotens. Zusammengefasst stellt der vorliegende Fall die erste beschriebene Batai-Virus assoziierte ZNS-Erkrankung eines natürlich infizierten Säugetieres und den ersten dokumentierten Fall einer Batai-Virusinfektion eines marinen Säugers dar. Daher sollten Batai-Viren als neurotrope Viren bei Seehunden in Betracht gezogen werden.

Der fünfte Teil beschreibt den Nachweis von APPV in mehreren Organen von Ferkeln mit kongenitalem Tremor. Mittels Luxol-Fast-Blau-Färbung war eine geringgradig reduzierte Färbeintensität in der lateralen weißen Substanz des Rückenmarks bei 4 von 6 erkrankten Ferkeln zu beobachten, während die gleichaltrigen, klinisch unauffälligen Kontrolltiere eine reguläre Myelinisierung aufwiesen. Eine FISH zeigte, dass APPV im ZNS einen Tropismus für Neuronen der inneren Körnerzellschicht des Kleinhirns hat. Nichtsdestotrotz waren im Kleinhirn positiver Ferkel keine histomorphologischen Veränderungen zu beobachten. Allerdings wiesen die APPV-positiven Ferkel klinische Anzeichen von kongenitalem Tremor auf. Diese Beobachtung unterstreicht die Rolle von APPV bei der Entwicklung von kongenitalem Tremor.

Im sechsten Teil der Arbeit wurde im Lebergewebe von Tinamus mit nekrotisierender Hepatitis ein aviäres Hepadnavirus nachgewiesen. Mittels FISH zeigten sich intraläsional virale Nukleinsäuren, sodass dem aviären Hepadnavirus eine Rolle bei der Entwicklung nekrotisierender Hepatitiden zugeschrieben werden sollte. Darüber hinaus wurden virale Nukleinsäuren in den Nieren und Hoden eines Tinamus nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet auf eine Virämie hin. Obwohl eine Virämie für Hepadnaviren beschrieben ist, war das ZNS allerdings negativ für das aviäre Hepadnavirus.

Der siebte Teil der Arbeit beschreibt die Untersuchung auf verschiedene Pathogene bei Füchsen, Steinmardern und Waschbären mit lymphohistiozytärer Enzephalitis. Trotz der Verwendung von Immunhistochemie für typische neurotrope Viren und NGS bleibt die Ursache der Veränderungen jedoch offen. Ob dies auf die Nachweisgrenze der verwandten Methoden oder auf sekundäre, Pathogen-assoziierte Mechanismen, wie molekulares Mimikry oder epitope spreading zurückzuführen ist, sollte bedacht und in weiteren Studien untersucht werden.

Abschließend lässt sich sagen, dass die zum Nachweis einiger neuartiger Viren angewandten Ergebnisse der Vergleichsstudie verschiedener ISH Techniken die Wichtigkeit der Methode unterstreicht.

 

abstract (englisch)

In situ hybridization (ISH) represents a useful tool for the visualization of viral nucleic acids in different tissue specimens. The aims of the present study are (i) to compare three different ISH methods in their effectivity for the discovery of different viruses and (ii) the application of obtained data in the detection of novel as well as emerging and re-emerging pathogens.

The first part of the thesis focused on a comparative analysis of three different ISH techniques for the detection of 8 different viruses in various tissues [5 RNA viruses: atypical porcine pestivirus (APPV) in the cerebellum of pigs, bovine hepacivirus (BovHepV) in the liver of cows, equine hepaciviurs (EqHV) in the liver of horses, Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) in the nose of camels, Schmallenberg virus (SBV) in the cerebrum of goats and 3 DNA viruses: canine bocavirus 2 (CBoV-2) in the intestine of dogs, porcine bocavirus (PBoV) in the spinal cord of pigs and porcine circovirus type 2 (PCV-2) in the lung, the pulmonary lymph node and the cerebrum of pigs]. The compared methods include (i) chromogenic ISH (CISH) with the use of self-designed digoxigenin (DIG)-labeled RNA probes using the pCR4-TOPO vector for the detection of RNA and DNA viruses, (ii) CISH with the use of DIG-labeled commercially produced RNA (equine hepacivirus) or DNA probes (DNA viruses) and (iii) fluorescent ISH (FISH) using a commercially available RNA probe mix (Thermo Fisher Scientific) for the detection of RNA and DNA viruses. In total, the RNA probe mix detected 7 of 8 viruses (87.5%), but failed to detect MERS-CoV in the decalcified nose of a camel. The self-designed RNA probes detected 50% of tested viruses, 2 RNA and 2 DNA viruses, respectively. The commercially produced DNA probes detected 66.67% of DNA viruses, but the probes for EqHV failed to detect the virus. Three viruses, SBV, CBoV-2 and PCV-2 were detected by all tested probes. Cell-associated positive areas and total tissue areas of stained slides were measured and the percentage of the positive area was calculated. The positive area was largest using the RNA probe mix for CBoV-2 and PCV-2 in all tested tissues. In contrast, for SBV, the anti-sense RNA probe detected the largest positive area in the cerebrum of a goat.

Regarding the material costs, 10€ per slide have to be considered for the digoxigenin labeled probes, self-designed RNA and commercially produced RNA and DNA probes, including probe synthesis and ISH procedure. In contrast, ISH of one slide using the RNA probe mix, which revealed a high detection rate, costs at least 60€. Evaluation of time was performed in three different categories, which are (i) pure working time, (ii) working time including incubation periods and (iii) total time beginning with the probe, kit and plasmid order. Regarding the pure working time and the working time including incubation periods, the commercially available RNA probe mix is the fastest with 3 or 13 hours, respectively. This is also a cost-saving aspect. The major drawback of this method is a long order time of 21 days. In contrast, ISH with commercially produced or self-generated probes takes about 10 and 16 days, respectively.

Summarized, ISH is a very useful tool in virus discovery. However, the choice of the most suitable ISH technique is very case-dependent, as factors including time, costs and detection rate differ for the various techniques, viruses and tissues. However, the RNA probe mix showed the highest detection rate for the tested viruses.

The second part of the thesis deals with the detection of PBoV in the spinal cord of a pig suffering from encephalomyelitis using next generation sequencing (NGS) and FISH. This is the first report of PBoV in the central nervous system (CNS) of pigs. Interestingly, human bocavirus has been isolated from the cerebrospinal fluid of patients suffering from encephalitis, before. Nevertheless, the use of FISH shows the neurotropism of PBoV as viral nucleic acids were visualized within the cytoplasm and nucleus of neurons. FISH was used to show a correlation of detected lesions and virus, which gives a strong hint on the pathogenicity of PBoV as the isolation of the virus failed and thus, Koch´s postulates cannot be fulfilled.

The third part describes the detection of feline panleukopenia virus (FPV) in the CNS of a cat with clinical signs of ataxia and histopathologically detected intraneuronal vacuoles. FPV has been demonstrated in neurons in cats before. However, the in situ detection of viral nucleic acids and proteins using CISH and immunohistochemistry in vacuolated neurons, in glial and in endothelial cells point on a new manifestation pattern of FPV in cats, as FPV infections of the feline CNS are usually restricted to cerebellar malformations.

The fourth part deals with the detection and visualization of Batai virus in the CNS of a seal suffering from meningoencephalomyelitis using virus isolation, NGS and FISH. Viral nucleic acids were detected in several CNS regions including cerebrum, cerebellum and spinal cord. Furthermore, Batai virus was detected within the tunica mucosa of the small intestine and in cortical and medullary lymphocytes of the pulmonary lymph node. RT-PCR substantiated the results, as the highest viral loads were detected in CNS material, followed by intestine. FISH of the CNS of eight further seals with similar histopathological alterations was negative. However, another seal from the same zoo that died two months prior due to acute renal failure showed a positive Batai virus specific signal within glomeruli and renal tubular epithelial cells, cells of the tunica mucosa of the small intestine and cortical and medullary lymphocytes of the pulmonary lymph node. Summarized, this is the first documented Batai virus associated CNS disease in a naturally infected mammal and the first documented case of Batai virus infection in marine mammals. Therefore, Batai virus should be considered as a neurotropic virus in seals.

The fifth part describes the detection of APPV in several organs of piglets with congenital tremor. A mild reduced staining intensity accentuated in the lateral white matter of the spinal cord was detected in four out of six diseased animals using luxol fast blue staining, while two age-matched, clinically unaffected control animals revealed regular myelination. FISH shows that, regarding the CNS, APPV has a tropism for neurons of the inner granular cell layer of the cerebellum. Nevertheless, histopathologic changes were missing in the cerebellum of positive piglets. However, the evidence of APPV genomes in newborn piglets affected by congenital tremor, in contrast to unaffected piglets, underlines the potential role of APPV in the development of congenital tremor.

In the sixth part of the work, tinamous with necrotizing hepatitis were found to be positive for avian hepadnavirus using NGS. Viral nucleic acids were detected intralesionally by FISH assigning avian hepadnavirus a role in the development of necrotizing hepatitis. Furthermore, viral nucleic acids were detected by FISH in the kidneys and testes of a tinamou, maybe as a result of viremia. Nevertheless, although viremia is described for hepadnaviruses, the CNS was negative for avian hepadnavirus.

The seventh part of the thesis describes the investigation of pathogens in foxes, stone martens and raccoon dogs with lymphohistiocytic encephalitis. However, despite the use of immunohistochemistry for typical neurotropic viruses and NGS, the cause of disease remains unknown. Whether this is due to the limitation of the used method or secondary causes of pathogen-related mechanisms including molecular mimicry and epitope spreading has to be considered and needs to be investigated in further studies.

Summarized, the implemented results of the technical comparison of different in situ hybridization techniques for the discovery of a series of newly discovered viruses underline the importance of this detection system.

keywords

In situ-Hybridisierung, Virus, Enzephalitis; in situ hybridization, virus, encephalitis

kb

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