Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Enzo Angiolino Orlando D´cundi

 

In vitro susceptibility of glial cells obtained from the adult canine brain for

different strains of canine distemper virus

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-97308

title (ger.)

In vitro Empfänglichkeit glialer Zellen des adulten Hundegehirns für verschiedene Staupevirus-Stämme.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/orlandoe_ss09.pdf

abstract (deutsch)

Das kanine Staupevirus (Canine distemper virus, CDV) induziert häufig eine demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis (DL) beim Hund. Aufgrund morphologischer Ähnlichkeiten der neuropathologischen Veränderungen bei DL und Multipler Sklerose wird die kanine Erkrankung als ein wichtiges natürliches Tiermodell für die Untersuchung demyelinisierender Erkrankungen des Menschen angesehen. Es existieren ein Serotyp und mehrere kozirkulierende Genotypen des Staupevirus mit unterschiedlicher Virulenz und Zelltropismus. Obwohl die Staupe vorwiegend jung-adulte Hunde betrifft, waren bislang Zellkulturstudien aufgrund methodischer Schwierigkeiten auf die Analyse neonataler Zellen angewiesen. Darüber hinaus ist bekannt, dass die zelluläre Zusammensetzung des ZNS und gewonnener ZNS-Kulturen einem lebenslangen Wandel unterliegt. Inwiefern in vivo Daten von neonatalen Hunden extrapolierbar für ältere Tiere sind und somit ein adäquates Modellsystem zum Studium der CDV-Infektion in situ darstellen wurde bis jetzt nicht näher untersucht. Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es daher, Zellkulturen des adulten Hundegehirns als Modellsystem für die Untersuchung des Zelltropismus bei der Staupevirus-Infektion zu etablieren. Zellkulturen des adulten Hundegehirns bestanden aus Mikroglia, Astrozyten und Fibroblasten, die jeweils mit Antikörpern gegen Iba1, GFAP und Vimentin identifiziert werden konnten. Hauptbestandteil der Kulturen waren jedoch bipolare, im weiteren Verlauf als Schwann-Zellähnliche Gehirnglia (Schwann cell-like brain glia, SCBG) bezeichnete Zellen, die den Neurotrophinrezeptor p75 (p75NTR) exprimierten. Die Zusammensetzung der Kulturen vom adulten Hundegehirn unterscheidet sich damit deutlich von  der des neonatalen Hundegehirns, die Neuronen und Oligodendrozyten nicht aber SCBG enthalten. SCBG besaßen hierbei nicht nur die bi- und tripolare Morphologie von Schwann-Zellen, sondern proliferierten auch auf typische Schwann-Zellmitogene wie z.B. FGF-2 und HGR-1β. Adulte Hundegehirnzellkulturen wurden mit attenuierten Staupevirus-Stämmen (CDV-OndeGFP, CDV-R252; CDV-Ond; CDV-2544) und einem Nerz-virulenten  Virusstamm (CDV-5804PeGFP) infiziert. Im Gegensatz zu den bislang ausnahmslos analysierten neonatalen Zellkulturen, konnte eine Virusstamm-spezifische Infektion bzw. ein stammabhängiger Zelltropismus beobachtet werden. Während einige der Stämme, wie in neonatalen Zellkulturen, alle gliale Zellen  infizierten, zeigten andere eine selektive Gliazell-Infektion. Diese differentielle Empfänglichkeit adulter kaniner Glia ist sehr wahrscheinlich auf unterschiedliche zelluläre Determinanten und entwicklungsabhängige Eigenschaften der Zellen zurückzuführen. Methodische Probleme, wie z.B. die Veränderung viraler Eigenschaften, ausgelöst durch die genetische Modifikation des GFP-exprimierenden CDV Klones, können ausgeschlossen werden, da der nicht-modifizierte CDV-Ond Stamm ebenfalls nicht zu einer Infektion von Astrozyten und lediglich zu einer Infektion weniger Mikrogliazellen führte. Interessanterweise zeigte sich SCBG stark empfänglich für alle Virusstämme. Diese Beobachtung ist neu und unerwartet, da SCBG oder ähnliche Zellen bislang im Zusammenhang mit der Staupeinfektion nicht untersucht wurden. Zwei mögliche Erklärungen sind hier denkbar. Entweder werden SCBG lediglich in vitro infiziert oder aber diese Zellpopulation ist bislang bei der Analyse aufgrund nicht verfügbarer Zelltyp-spezifischer Marker übersehen worden. SCBG könnte eine wichtige Rolle bei der Infektion und Ausbreitung sowie der Persistenz des Staupevirus spielen. Zukünftige Studien müssen daher das Ziel haben, die pathophysiologische Rolle dieser Zellpopulation bei der Staupevirus-Infektion des ZNS näher zu beleuchten. Zur Untersuchung der Bedeutung von Zell-Zell-Interaktionen für die Virus-Empfänglichkeit glialer Zellen, wurden SCBG in Mischkultur und in gereinigter Form mit verschiedenen Staupevirus-Stämmen infiziert. Interessanterweise wiesen SCBG in gereinigten Kulturen eine im Vergleich mit der Mischkultur deutlich verringerte Empfänglichkeit für das Virus auf. Darüber hinaus zeigten gereinigte SCGBs weniger ausgeprägte morphologische Veränderungen nach eine CDV-Infektion als kutane Fibroblasten. Letztere waren empfänglicher für die unterschiedlichen CDV-Stämme und zeigten einen ausgeprägten CPE. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass bislang noch nicht genauer charakterisierte Zell-Zell-Interaktionen die Empfänglichkeit glialer Zellen für das Staupevirus beeinflussen. Die Beobachtung, dass Fibroblasten in Misch- und Reinkultur die gleiche Empfänglichkeit für das Virus aufwiesen, deutet daraufhin, dass es sich bei dem beobachteten Phänomen nicht um einen generellen Effekt handelt, sondern dass zelltypspezifische Mechanismen bei der Infektion von SCBG, deren pathophysiolgische Bedeutung in weiteren Studien geklärt werden muss, eine Rolle  spielen. Welche Bedeutung hierbei dem Neurotrophinrezeptor p75 zukommt sollte in zukünftigen Studien untersuchet werden.

 

abstract (englisch)

Canine distemper virus (CDV) induces a demyelinating leukoencephalomyelitis (DL) in dogs. Due to morphological similarities of the neuropathological changes found in DL and multiple sclerosis, the canine disease represents an important naturally-occurring animal model for human demyelinating disorders. Though there exists only one serotype of CDV, several co-circulating genotypes with different virulence and cell tropism have been described. Although CDV is a disease that affects adult dogs, in vitro studies so far were limited to the analysis of neonatal cells due to methodological problems. In addition, it is well known that the cellular composition of the CNS and of obtained cultures undergoes changes during lifetime. Whether data from neonatal animals are, therefore, true representatives of the in vivo situation and suitable as a model for the analysis of CDV infection in vivo remained to be established. The principal aim of the present study was, therefore, to establish an in vitro model using glial cells from adult dogs suitable for the analysis of CDV susceptibility and cell tropism. Cell cultures from the adult canine brain were established successfully and consisted mainly of cells that expressed p75NTR designated Schwann cell-like brain glia (SCBG). In addition, astrocytes, microglia, and fibroblasts, reactive with anti GFAP-, anti-Iba1-, and anti-vimentin, respectively, were found. This cellular composition is clearly different from neonatal cultures, where neurons and oligodendrocytes but not SCBG were detected. Interestingly, SCBG was the predominant component of the cultures. These cells did not only display the bi- to tripolar morphology typical of Schwann cells and OECs, but also proliferated in response to typical Schwann cell mitogens, such as FGF-2 and HRG-1β. Cultures were infected with the attenuated (CDV-OndeGFP, CDV-R252; CDV-Ond; CDV-2544) and a mustelid virulent (CDV-5804PeGFP) strain. Contrary to neonatal brain cell cultures, a CDV-strain specific cell tropism could be observed. Though some strains, like in the neonate, infected all glial cells to the same extent, others displayed a selective target spectrum. This differential susceptibility of adult canine glia in vitro is most likely due to differences in the cellular determinants and development-dependent properties of the cells. Methodological problems, such as alteration of virus properties caused by the genetic modification of the GFP-expressing CDV clones can be ruled out, because the non-modified CDV-Ond strain did also not infect astrocytes and only a few microglial cells were virus positive. Surprisingly, SCBG were frequently infected by all CDV strains used. This result represented an unexpected novel finding since infection of these cells by CDV has so far neither described in vitro nor in vivo. Two possible explanations for the lack of in vivo data about this cell type are conceivable. Either SCBG is infected in vitro only, or infection of these cells in vivo has been overlooked so far. It seems that SCBG apparently may play an important role for viral infection initiation, spread, and persistence. Further studies are, therefore, needed to elucidate the pathogenic role of this glial cell population during the CNS infection of CDV. To study the relevance of cell-cell interactions of SCBG susceptibility to CDV, SCBG in mixed brain cell cultures and after purification were exposed to different CDV strains. In contrast to the high percentage of CDV-infection of mixed brain cell cultures, purified SCBG was infected at a low percentage only. Additionally, purified SCBG showed less pronounced morphological changes following CDV infection compared to cutaneous fibroblasts. The latter were more susceptible to the different CDV strains used and displayed a severe CPE. The low susceptibility of purified SCBG argues for the presence of so far undetermined cell-cell interactions and/or soluble mediators that may influence individual cell susceptibility to CDV infection in vitro. The fact that purified SCBG but not fibroblasts displayed a reduced infection rate following purification suggests that this is not a general phenomenon dependent on the cell type and implies that a novel aspect of CDV infection has been observed. Further studies have to demonstrate, however, the exact role of SCBG in the development of DL lesions and its possible interaction with other glial cells. Similarly, the role of p75NTR as a potential virus receptor needs to be addressed in futures studies.

 

keywords

Empfänglichkeit, Staupevirus, Zelltropismus; susceptibility, Aldynoglia, CDV

kb

4.396