Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Meltem Özer

 

Charakterisierung genetisch modifizierter dopaminerger Progenitorzellen in vitro und in situ – immunzytochemische, biochemische und elektrophysiologische Untersuchungen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103383

title (engl.)

Characterisation of genetically modifies dopaminergic progenitor cells in vitro and in situ- immunocytochemical, biochemical and electrophysiological study

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/oezerm_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Morbus Parkinson ist gekennzeichnet durch den Verlust dopaminerger (Da) Neurone in der Substantia nigra (SN). Dadurch kommt es zu motorischen Störungen wie Tremor (Zittern), Akinese (Verlust von Bewegung), Bradykinese (verlangsamte Bewegung) und Rigor (Muskelsteifheit). Bei der Zellersatztherapie werden die degenerierten Neurone ersetzt, wodurch das Da System restauriert und regeneriert wird. Embryonale Vorläuferzellen aus dem ventralen Mesencephalon (VM) wurden in verschiedenen in vivo Studien in das Striatum transplantiert und zeigten Verbesserungen der motorischen Fähigkeiten. Trotzdem ist die Zellersatztherapie mit diesen Zellen durch ihre geringe Verfügbarkeit umstritten, da bei einer Transplantation in das Striatum eines Parkinson-Patienten sechs bis acht Föten benötigt werden. Ein weiteres Problem stellt das geringe Überleben der transplantierten Zellen, das nur 1-5 % beträgt, dar.

Ziel der Arbeit war es, embryonale Vorläuferzellen aus dem ventralen Mesencephalon in vitro zu expandieren und zu differenzieren, so dass die Zellen vor der Transplantation eine erhöhte Anzahl von Da-Neuronen und ein verbessertes Überleben nach der Transplantation aufweisen. Mittels Nukleofektion wurden VM-Vorläuferzellen mit BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) überexprimierenden Plasmiden transfiziert. Als Reportersequenz enthielt das Plasmid ein Flag-Epitop, welches mit einem Antikörper detektiert werden konnte. Nukleofektion ist eine effektive, nicht-virale Transfektionsmethode, bei der allerdings 60 % der dopaminergen Neurone in der Kultur absterben. Die sogenannte Colayermethode erlaubt es, nur ein Drittel der Zellen abzulösen und zu transfizieren, wodurch zwei Drittel der Zellen in der Kultur unberührt bleiben. Die Anzahl der Da-Neurone unterscheidet sich dann nicht mehr von unbehandelten Zellen. Auch wenn nur ein Drittel der transfiziert wurde, wirkt das sezernierte BDNF-Flag Protein positiv auf das Überleben und die Differenzierung der Da-Neurone, da dieser an den trkB-Rezeptor der Da-Neurone bindet und Signalwege induzieren kann. Die anderen neurotrophen Faktoren, GDNF (Glial cell-line derived neurotrophic factor), MANF (Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor) und CDNF (Cerebral dopamine neurotrophic factor) unterschieden sich in der Anzahl der Da-Neurone nicht signifikant von der Kontrolle. Gemeinsam bietet die Colayerkultur mit der Transfektion von BDNF-Flag eine Möglichkeit, die Anzahl der Da-Neurone in vitro um ca. 30 % zu erhöhen.

Die Transplantation der Da-Neurone resultiert in einer Verbesserung der motorischen Fähigkeiten, welche durch eine Überkompensation in Amphetamin-Induzierten Rotationsexperimenten verdeutlicht wird. (Ratzka A, 2012) Dennoch ist wenig über die elektrophysiologischen Eigenschaften der Da-Neurone nach Transplantation bekannt. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften intrastriatal transplantierter Da-Vorläuferzellen zu untersuchen, wurden 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) lädierte Sprague Dawley Ratten intrastriatal mit transfizierten fötalen mesencephalen Progenitorzellen transplantiert. Mit Hilfe von Enhanced green fluorescent protein (EGFP)-Flag Transfektion ist es möglich, die Transplantate auch noch bis zu 19 Wochen nach Transplantation zu detektieren. Vergleichend wurden Tyrosinhydroxylase (TH)-EGFP Vorläuferzellen aus transgenen Mäusen untersucht, die eine direkte Ableitung von markierten Da-Neuronen in dissoziierten Kulturen erlauben. Zusammengefasst kann man sagen, dass Da-Neurone charakteristische Merkmale aufweisen. Besonders kennzeichnend ist der hyperpolarisations-aktivierte Einwärtsstrom der bei einem Membranpotential ab -100 mV und darunter auftritt. Dieser konnte sowohl für TH-GFP Neurone in vitro als auch für intrastriatal transplantierte Neuronen gezeigt werden. Die Gruppe der Neurone mit hyperpolarisations-aktivierten rektifizierendem Strom zeigen Frequenzadaptation, die denen der TH-GFP positiven ähneln, aber in ihrer Ausprägung stärker variieren. In vitro und in intrastriatal transplantierten Neuronen konnten relativ deutliche Schrittmachereigenschaften gemessen werden, welches ein weiteres Merkmal für Da-Neurone darstellt. In den intrastriatal transplantierten Neuronen konnten insgesamt mehr spontan aktive Neurone abgeleitet werden als in vitro. Die TH-GFP positiven Neurone in vitro waren gekennzeichnet durch breite Aktionspotentiale mit großen Nachhyperpolarisationsamplituden. Diese konnte auch für alle intrastriatal transplantierten Neurone nachgewiesen waren.

Zusammengefasst kann man sagen, dass die analysierten Neurone in den Hirnschnitten ähnliche elektrophysiologische Eigenschaften zeigen wie Da-Neurone der TH-GFP Kultur in vitro. Zudem stimmen die Eigenschaften der untersuchten intrastriatal transplantierten Neurone mit denen der Literatur über Da-Neurone in der SN in vivo überein (Richards et al., 1997). Unsere Daten zeigen die elektrophysiologische Funktionalität transplantierter Da-Neurone noch 3-19 Wochen nach Transplantation.

 

abstract (englisch)

Parkinson’s disease is characterized by a severe loss of Da-neurons in the SN, resulting in Tremor, Akinesia, Bradykinesia, and Rigor. Cell transplantation represents a possibility to restore and repair the DA system. Embryonic progenitor cells derived from the VM and grafted to the striatum, improved motor skills in vivo and clinical studies, though cell replacement therapy is debatable, because six to eight foetuses are required for grafting and the survival rate is rather low (1-5 %).

The aim of my study is to increase the number of Da-neurons by different methods in vitro, to achieve a higher number of surviving Da-neurons in grafts in vivo. Nucleofection is an effective, non-viral transfection method, because it leads to an increased cell number compared to other methods. The colayer method allows the transfection of only one third of the cells while the rest stays untouched. The amount of Da-neurons doesn’t differentiate from the other cells. The transfection with BDNF-flag plasmid increases the number of Da-neurons through binding to the trkB-receptor. No differences in the cell number where seen compared to other neurotrophic factors like GDNF, MANF, and CDNF.

So far, there is only little data on the electrophysiological characteristics of Da-neurons after grafting. Therefore I transplanted transfected mesencephalic progenitor cells into the striatum of 6-OHDA lesioned rats. With EGFP-flag transfection it is possible to detect the grafts for up to 19 weeks post grafting. We analyzed TH-EGFP progenitor cells of transgenic mice, which allow a direct recording of marked Da-neurons in dissociated cultures, and compared these results to the previous ones.

Da-neurons have characteristic properties including the hyperpolarisation-activating IH-current, which shows membrane potentials of -100 mV and less. I detected this IH –current for TH-GFP neurons in vitro and for the intrastriatal grafted neurons. The neurons with hyperpolarisation-activated rectifying current show frequency adaptation and are similar to the TH-GFP-positive neurons. However, they variegate more. I determined pacemaker activity in vitro and in the intrastriatally grafted neurons, which is another characteristic of Da-Neurons. The grafted neurons showed more spontaneously active neurons than those in vitro. The TH-GFP-positive neurons had wider APs with large AHPs.

To conclude, the analyzed neurons in the brain slices in vivo had similar characteristics to the cultured TH-GFP-positive neurons (Richards et al., 1997). My data displays the electrophysiological functionality of grafted Da-neurons between 3 and 19 weeks after grafting.

 

keywords

Parkinson, Transplantation, intrastriatal, electrophysiology, BDNF, dopaminergic

kb

7.857