Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Joanna Nölke

Charakterisierung der Leydig Zellen und Untersuchung möglicher Ursachen für eine funktionelle Spermatogenese in einzelnen Samenkanälchen

von homozygoten SCCx43KO-/-- Mäusen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105130

title (engl.)

Characterization of Leydig cells and elucidation of possible causes for functional spermatogenesis in single tubules of homozygous SCCx43KO-/--mice

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/noelkej_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Im Hoden, sowie im gesamten Organismus, existieren verschiedene Formen der interzellulären Kommunikation. Gap junction (GJ)-Kanäle nehmen dabei eine besondere Rolle ein, da über sie die Zytoplasmata zweier benachbarter Zellen direkt miteinander verbunden werden und auf diesem Wege Stoffe, z. B. Botenstoffe oder Metaboliten, ausgetauscht werden können. GJ im Hoden bestehen zwischen Sertoli Zellen (SZ), zwischen SZ und Keimzellen (KZ) sowie zwischen Leydig Zellen (LZ). Die kleinsten Bausteine der GJ sind die Connexine (Cx), von denen Cx43 das vorherrschende testikuläre Cx von vielen Säugetieren ist. In Nagern wurde Cx43 sowohl in den somatischen SZ und LZ, als auch in KZ (Spermatogonien, Spermatozyten sowie Spermatiden) detektiert. Im Menschen wurde eine verminderte Cx43-Expression bei infertilen Patienten oder pathologisch veränderten Hoden beobachtet. In Nagetieren wurde gezeigt, dass Cx43 die Proliferation und Reifung der SZ beeinflusst, eine essentielle Rolle bei der Initiierung und Aufrechterhaltung der Spermatogenese einnimmt und möglicherweise in die Steroidsynthese der LZ involviert ist. Erste Erkenntnisse darüber wurden in konstitutiven Cx43-Knockout (KO)-Mäusen gewonnen. Da diese Tiere aber perinatal versterben, war es unmöglich, die Auswirkungen im pubertären und adulten Hoden nachzuvollziehen. Um Einblicke in die Rolle von Cx43 für die Spermatogenese in vivo zu erlangen, wurde daher ein SZ-spezifischer KO von Cx43 entwickelt. Die homozygoten SCCx43KO-Mäuse sind lebensfähig, weisen aber eine stark beeinträchtigte Spermatogenese mit Sertoli cell only-Syndrom, Spermatogonienarrest, SZ-Clustern und vielen intratubulären Vakuolen auf. Interessanterweise werden in einigen Samenkanälchen aber dennoch verschiedene Stufen an KZ ausgebildet, z. T. sogar elongierte Spermatiden. Das könnte ein Hinweis auf eine funktionelle Kompensation von Cx43 durch ein anderes testikuläres Cx in diesen wenigen Tubuli sein. Des Weiteren hat der SZ-spezifische KO von Cx43 möglicherweise auch Auswirkungen auf die Proliferation der LZ-Population, die eventuell eine Hyperplasie entwickelt.

Die beiden letztgenannten Aspekte waren Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Bezüglich der residualen Spermatogenese wurden Untersuchungen zur Cx-Expression in den SCCx43KO-/--Mäusen durchgeführt, die neben Cx43 drei weitere intratubuläre Cx (Cx26, Cx33, Cx45) umfassten. Alle verwendeten Tiere wurden zunächst genotypisiert und in der Hämatoxylin-Eosin-Färbung phänotypisch überprüft. Eine weitere Bestätigung der Cx43-Gendeletion ergab sich aus der β-Galaktosidase Immunhistochemie (IHC), in der nur die SZ-Kerne der SCCx43KO-/--Mäuse sowohl in Tubuli ohne als auch mit Spermatogenese positiv waren. Im Hodenhomogenat der SCCx43KO-/--Mäuse wurde auf mRNA-Ebene eine deutliche Bande für Cx43 detektiert, auf Protein-Ebene zeigte sich allerdings eine signifikante Reduktion von Cx43. Die semiquantitative Analyse des Western Blots zeigte, dass die SCCx43KO-/--Mäuse nicht mal ein Fünftel der Cx43-Menge der Wildtyp (WT)-Mäuse aufwiesen. Die Cx43 IHC, die mit zwei verschiedenen Antikörpern durchgeführt wurde, lieferte nicht ganz eindeutige Ergebnisse. Während mit dem ersten Antikörper vereinzelt positive Reaktionen in wenigen Tubuli der SCCx43KO-/--Hoden auf Höhe der Blut-Hoden-Schranke, also ähnlich wie beim WT, detektiert wurden, fanden sich beim zweiten Antikörper keinerlei solche Reaktionen. Die meisten Tubuli mit Spermatogenese waren bei beiden Antikörpern immunonegativ. In den KZ (Spermatozyten/Spermatiden) waren vereinzelt positive Reaktionen zu beobachten, während die LZ immunonegativ blieben. Um für die erste Fragestellung gezielt Samenkanälchen der SCCx43KO-/--Mäuse mit und ohne Spermatogenese sowie WT-Tubuli vergleichen zu können, wurde die Laser-Mikrodissektion angewendet. So konnten ausgewählte Tubuli ausgeschnitten werden und das gewonnene Material in einer anschließenden RT-qPCR hinsichtlich der Cx43-Expression quantitativ bewertet werden. In den Tubuli ohne sowie mit Spermatogenese war Cx43 signifikant reduziert. Dass sich dennoch Cx43-mRNA im gelaserten Material befand, lässt sich möglicherweise mit der Expression in den KZ oder peritubulären Zellen erklären.

Die Untersuchung weiterer Cx zeigte, dass Cx26, Cx33 und Cx45 auf mRNA-Ebene im Hodenhomogenat der SCCx43KO-/--Mäuse exprimiert werden. Aufgrund fehlender geeigneter Antikörper konnten Cx26 und Cx33 nicht auf Proteinebene (mittels IHC) untersucht werden. Cx45 ist ein aussichtsreicher Kandidat für eine mögliche Kompensation für Cx43 im Keimepithel, da es sowohl in SZ als auch in KZ nachgewiesen wurde. Eine für Cx45 durchgeführte IHC zeigte für beide Genotypen eine vergleichbare Lokalisation in den Spermatozyten und Spermatiden. Interessanterweise war Cx45 auf transkriptionaler Ebene in den SCCx43KO-/--Tubuli mit Spermatogenese stark und signifikant hochreguliert.

Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse auf einen erfolgreichen Knockout des Cx43-Gens in den SZ hin. Gleichzeitig gibt die stark hochregulierte Expression von Cx45 einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Prozess für Cx43 durch Cx45 während der residualen Spermatogenese. Die Untersuchung weiterer Cx mittels IHC und RT-qPCR an mikrodisseziertem Material könnte mehr Einblicke in die Dynamik der Spermatogenese und deren Kompensationsmechanismen liefern.

Die vorläufige Charakterisierung der LZ ergab keine Hinweise auf eine veränderte Proliferation oder Differenzierung. Marker für die adulte LZ-Population und die Steroidsynthese (17β-HSD III und 3β-HSD VI) waren auch in adulten SCCx43KO-/--Mäusen exprimiert. Dagegen war nur eine schwache Expression des fetalen LZ-Markers (Thrombospondin2) zu beobachten. Als eine Auswirkung des SZ-spezifischen KO von Cx43 war allerdings eine veränderte Cx-Expression in den LZ zu finden. Die in der IHC beobachtete fehlende Immunreaktion für Cx43 und Cx45 in den LZ der SCCx43KO-/--Mäuse spiegelte sich in einer reduzierten mRNA-Expression beider Cx in mikrodisseziertem interstitiellem Gewebe wider. Cx45 konnte allerdings auch in WT-Mäusen mittels IHC nicht detektiert werden. Ob die Herabregulation von Cx43 und Cx45 in den LZ eine direkte Folge des SZ-spezifischen KO von Cx43 ist, oder indirekt durch die veränderte Morphologie des Hodens entsteht, ist hier nicht ersichtlich. Trotz der verminderten Cx-Expression scheinen die LZ aber in der Lage zu sein, Androgene zu bilden, so wie es verschiedene Studien vermuten lassen.

abstract (englisch)

Intercellular communication is an essential aspect of maintaining organ functions. This includes paracrine and endocrine mechanisms as well as the direct communication via gap junctions (GJ). These channels link the cytoplasms of two adjacent cells and allow the passage of transmitters and small metabolites. In the testis, GJ exist e. g. between Sertoli cells (SC), between SC and germ cells (GC) and between Leydig cells (LC). They consist of small protein subunits, the connexins (Cx), of which Cx43 is the predominant Cx in the testis of many species. In men, an altered Cx43 expression is associated with infertility or testicular cancer. In rodents, it could be demonstrated that Cx43 is involved in the proliferation and differentiation of SC, plays an essential role in the initiation and maintenance of spermatogenesis, and is possibly involved in steroidogenesis of the interstitial LC. Constitutive Cx43 knockout (KO) mice gave first insights to these functions, but as these mice die perinatally, the effects on pubertal or adult testes could not be analyzed. To circumvent the perinatal death, mice with a SC-specific KO of the Cx43 gene (SCCx43KO) were generated. Histological analysis of homozygous KO mice (SCCx43KO-/-) revealed profound effects on the testicular phenotype. Most tubules display an arrest of spermatogenesis at the level of spermatogonia or SCO syndrome, intratubular SC clusters and vacuoles, and an apparent hyperplasia of LC. Nevertheless, some single tubules show normal spermatogenesis up to elongated spermatids.

The present study focussed on possible compensatory mechanisms regarding the residual spermatogenesis and on possible impacts on the interstitial LC. Therefore the expression of different known intratubular Cx (Cx26, Cx33, Cx45) including Cx43 was investigated. After genotyping and morphological evaluation by hematoxylin-eosin staining, the successful KO was confirmed by β-galactosidase staining. SC of tubules without and with residual spermatogenesis were immunopositive, implying a successful deletion of the Cx43 gene. Cx43 RNA was still detectable in testis homogenate of SCCx43KO-/--mice, but semiquantitative Western blot analysis revealed a significant reduction of Cx43 protein. Cx43 immunohistochemistry (IHC), performed with two different antibodies, provided ambiguous results. In some KO tubules with spermatogenesis immunopositive reactions at the level of the blood testis barrier could be detected, comparable with reactions in wildtype (WT) mice. These reactions were not detected with the second anti-Cx43 antibody. Most of the tubules with spermatogenesis were immunonegative with both antibodies. Laser microdissection was used to specifically compare Cx expression profiles of Cx43 and Cx45 in KO tubules with and without spermatogenesis and WT tubules. A subsequent RT-qPCR for Cx43 revealed a significant downregulation in tubules with and without spermatogenesis. The residual Cx43 expression might be due to the expression in GC or peritubular cells.

Using PCR, the expression of Cx26, Cx33 and Cx45 could be shown for SCCx43KO-/--mice. IHC for Cx45 revealed a similar localization in both genotypes between/in SC and spermatocytes/spermatids. Interestingly, Cx45 was upregulated on transcriptional level in picked KO tubules with spermatogenesis. This upregulation might be due to a compensatory role of Cx45 during spermatogenesis.

Preliminary data regarding the LC differentiation status and number do not indicate an altered proliferation or differentiation in the SCCx43KO-/--mice. LC marker expression (Thrombospondin2, 3β-HSD VI and 17β-HSD III) was comparable to WT mice. However, an alteration in the amount of expressed Cx mRNA could be detected. LC of SCCx43KO-/--mice revealed no positive immunoreactions for Cx43 or Cx45, and this was reflected in a significant downregulation of both Cx mRNA in microdissected interstitial tissue, as well as in a significant downregulation of Cx43 protein performing a semiquantitative WB on testis homogenates If this is a direct consequence of the SC-specific KO of Cx43 or an indirect effect of the altered morphology needs to be further elucidated. Nevertheless, the LC of the SCCx43KO-/--mice seem not to be impaired in spermatogenesis.

keywords

Connexine, Leydig Zellen, Spermatogenese, connexins, leydig cells, spermatogenesis 

kb

24.448