Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

André Dos Santos Nobre

 

Genetically modified ventral mesencephalic neuronal progenitor cells

Cellular and molecular characterization in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-98047

title (ger.)

Zelluläre und molekulare Charakterisierung von gentechnisch veränderten neuronalen Vorläuferzellen aus dem ventralen Mesencephalon der Ratte

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/nobrea_ws09.pdf

abstract (deutsch)

Die Erkrankung Morbus Parkinson (MP) ist durch eine selektive Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen der nigrostriatalen Nervenbahn gekennzeichnet. Eine mögliche Therapiestrategie beim MP stellt die Transplantation von in vitro differenzierten DA Neuronen in das Striatum der Patienten dar. Solche Zellen lassen sich beispielsweise aus neuronalen Vorläuferzellen (NVZ), die aus embryonalen Gehirnen isoliert wurden, generieren. Jedoch sind NVZs für die Zell-Lagerung und Transplantation nur eingeschränkt geeignet, da ihre Zellteilungsfähigkeit eingeschränkt ist.

Als alternativen Ansatz dazu, habe ich im ersten Teil meiner Arbeit die Teilungsfähigkeit und das DA Potential von SV40 large T Antigen (SV40Tag) immortalisierten NVZs, die aus dem ventralen Mittelhirn von Ratten Embryonen isoliert wurden, untersucht. Ausgewählte Klone wurden charakterisiert nach i) Expression von molekularen Markern für die DA Differenzierung, ii) Differenzierungspotential, iii) Kalzium-Imaging nach Kainat Zugabe, und iv) Immunohistochemischer Färbung nach Transplantation in das Striatum adulter Ratten. Jedoch führte selbst eine verminderte SV40Tag Expression mittels shRNA-silencing nicht zur erhofften DA-Differenzierung bei diesen Zellen. Jedoch konnte dabei eine Differenzierung zu Neuronen als auch Glia-Zellen nach 12-tägiger SV40Tag Suppression beobachtet werden, was auf eine Multipotenz der SV40Tag Zellen hindeutet. Eine Behandlung mit GDNF/dbcAMP bewirkt eine morphologisch erkennbare Reifung der Zellen und nach Zugabe von Kainat lassen sich neuronale Eigenschaften mittels Kalzium-Imaging nachweisen. Des Weiteren exprimieren solcherart behandelte Zellen mRNAs für den Dopamintransporter und die Tyrosin Hydroxylase (TH), jedoch lassen sich weiterhin keine immunreaktiven TH-positiven Neurone nachweisen. Nach intrastriataler Transplantation bei 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) geschädigten Ratten konnten neben SV40Tag immunoreaktiven Zellen auch GFAP, Nestin und ß-III Tubulin positive Zellen nachgewiesen werden, jedoch ebenfalls keine TH-positiven Zellen. Des Weitern lassen sich SV40Tag Zellklone effizient nicht-viral transfizieren, wie die Überexpression des enhanced green fluorescence protein (EGFP) zeigt. Für zukünftige Anwendung könnten SV40Tag Zellen dazu verwendet werden, um Neurotrophe Faktoren anstellen von EGFP zu exprimieren und somit bei Co-Kultivierung mit primären Neuronen deren DA-Differenzierung in vitro, bzw. deren Überleben nach Tansplantation, zu verbessern.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden primäre NVZ die aus dem ventralen Mittelhirn von Ratten Embryonen isoliert wurden untersucht. Diese Zellen lassen sich mit einem nicht-viralen EGFP-Expressionsplasmid effizient transfizieren und zeigen ein starkes EGFP Signal für mindestens 4 Wochen in vitro und bis zu 12 Wochen in vivo nach intrastriataler Transplantation. Ähnliche Plasmide, welche für Neurotrophe Faktoren (BDNF, CDNF, GDNF, FGF-218kd, MANF, Wnt5a) codieren, wurden für Expressionsversuche mit primären NVZs verwendet. Dazu wurden verschiedene Bioassays etabliert, wie i) Anzahl der gebildeten DA-Neurone, ii) Reifungsstadien der DA-Neurone (Anzahl an Neuriten), iii) Überleben von DA-Neuronen nach 6-OHDA Behandlung, und iv) Anzahl der gebildeten DA-Neurone nach Serum-Mangel. Dabei konnten für BDNF-exprimirende Kulturen eine erhöhte Anzahl an DA-Neuronen, bei GDNF transfizierten eine verstärkte DA-Reifung und bei FGF-218kd transfizierten Kulturen eine verminderte DA-Reifung festgestellt werden.

 

abstract (englisch)

Parkinson’s disease (PD) is characterized by a selective degeneration of dopaminergic (DA) neurons of the nigrostriatal pathway. One potential therapeutic strategy for PD represents the transplantation of in vitro differentiated DA neurons into the striatum of the patients. Such cells can be derived from neuronal progenitor cells (NPCs), which have been isolated from fetal brains. However, the use of NPCs for cell banking and transplantation might not be optimal since their mitotic competence is limited.

As an alternative approach I characterized in the first part of my thesis the proliferation ability and DA fate of SV40 large T antigen (SV40Tag) immortalized NPCs isolated from the ventral mesencephalon of rat embryos. Selected clones were characterized with regard to i) expression of molecular markers of the DA lineage, ii) differentiation potential, iii) calcium imaging in the presence of kainate, and iv) immunohistochemistry after intrastriatal transplantation into adult rats. Attempts to silence the expression of SV40Tag by shRNA failed to trigger differentiation into DA neurons, nevertheless differentiated cells of the neuronal and glial cell lineage were detected 12 days after SV40Tag suppression, indicating that SV40Tag cells are multipotent. GDNF/dbcAMP treated cells displayed morphological maturation and revealed neuronal properties in the presence of kainate as shown by calcium imaging studies. In addition, treated cells do express mRNAs of dopamine transporter and tyrosine hydroxylase (TH), however, no immunoreactive TH positive neurons were found. After intrastriatal transplantation into 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lesioned rats, SV40Tag immunoreactive cells were found in addition to GFAP, nestin, and β-tubulin type III positive cells, however, no TH positive cells were detected. The SV40Tag cell clones can be efficiently non-virally transfected as shown by over-expression of enhanced green fluorescence protein (EGFP). Thus, for further applications, SV40Tag cells clones engineered to produce neurotrophic factors in substitution of EGFP could be used as tool to enhance differentiation of primary neurons in vitro or, survival and maturation of grafted primary cells, when used in a co-culture format.

In the second part of this work primary NPCs isolated from the ventral midbrain of rat embryos were used. Transfection with a non-viral EGFP-expression plasmid resulted in a high transfection efficiency and strong EGFP signal for at least 4 weeks in vitro. Furthermore, after grafting these cells into neurotoxin lesioned rat brains, strong EGFP signals were detected up to 12 weeks in vivo. Similar plasmids encoding for candidate neurotrophic factors (BDNF, CDNF, GDNF, FGF-218kd, MANF, Wnt5a) were used for small scale expression assays with primary NPCs. Different bioassays were established, such as i) number of DA neurons generated, ii) maturation stages of the DA neurons (number of neurites), iii) number of DA neurons surviving after 6-OHDA treatment, and iv) number of DA neurons generated under serum deprivation conditions. Main results from this experiments include i) significant increase in the number of DA neurons in BDNF-transfected cell cultures, and ii) maturating effect of GDNF on DA neurons, contrasting with delayed maturation in FGF-218kd transfected cell cultures.

 

keywords

Neuronale Vorläuferzellen, Immortalisation, Differenzierung; neuronal progenitor cells, immortalization, differentiation

kb

8.939