Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Jana Katarin Nitz

 

Charakterisierung ausgewählter Genexpressionsmuster im porcinen Uterus und Ovar nach unilateraler, intrauteriner Infusion von Seminalplasma

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103370

title (engl.)

Characterization of selected gene expression patterns in the porcine uterus and ovary after unilateral, intrauterine infusion of seminal plasma

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/nitzj_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Expressionsmuster ausgewählter immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte im Uterus und Ovar östrischer Jungsauen zu untersuchen, nachdem diese eine unilaterale intrauterine Seminalplasmainfusion erhalten hatten.

Dazu fand ein In – vivo – Tiermodell Anwendung, bei dem unter chirurgischer Intervention gepooltes, porcines Seminalplasma in ein ligiertes Uterushorn appliziert wurde. Das kontralaterale Uterushorn stand nach Applikation von PBS als Kontrollseite zur Verfügung. Von sieben spontan östrischen Jungsauen wurden 17 h nach o. g. Behandlung folgende Proben gewonnen: Uterusepithel, Epithel des uterinen Anteils der UTV, Granulosazellen, Kumuluszellen und Oozyten. Nach unterschiedlicher Aufbereitung folgten Genexpressionsstudien mittels RT – qPCR für sechs Zielgene: Prostaglandin – Endoperoxide Synthase 2 (PTGS2), Pentraxin 3 (PTX3), Tumor Necrosis Factor Alpha – Induced Protein 6 (TNFAIP6), Tumor Necrosis Factor Alpha (TNFA), Interleukin 6 (IL6) und Peroxisome ProliferatorActivated Receptor Gamma 1 (PPARG1). Außerdem wurde die Expression des potentiellen Referenzgenes porcines Ubiquitin B (UBB) gemessen. Aufgrund der nicht stabilen Expression in der vorliegenden Studie wurde UBB allerdings nicht als Referenzgen, sondern lediglich als Positivkontrolle gewertet. In den Oozyten wurden abweichend die Expressionsstärken der spezifischen Transkripte c – Mos, Bone Morphogenic Protein 15 (BMP15), Growth Differentiation Factor 9 (GDF9), CyclinB1, CyclinDependent Kinase 1 (CDK1), Mitogen  - Activated Protein Kinase 1 (MAPK1), Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) und Zygote Arrest Gene 1 (ZAR1) untersucht.

Im Epithel des Uterus wurde 17 h nach Seminalplasmaappikation signifikant weniger PTGS2 exprimiert als im Epithel der Kontrollseite (p < 0,05). Für alle weiteren Zielzellen und -transkripte konnte kein Einfluss des Seminalplasmas auf die Expressionsstärke im Vergleich zur Kontrollseite nachgewiesen werden (p > 0,05). Die Transkripte PTGS2, TNFA und TNFAIP6 wurden im Epithel des Uterus höher exprimiert als im Epithel des uterinen Anteils der UTV. Das galt sowohl für die Seminalplasma- als auch für die Kontrollseite. Alle Werte erreichten statistische Signifikanz (p < 0,05), abgesehen von TNFAIP6 auf der Versuchsseite (p = 0,08).

Für zahlreiche Genexpressionsstärken konnten korrelative Zusammenhänge festgestellt werden.

Innerhalb der Seminalplasmaseite korrelierten folgende Werte: PTGS2 und IL6 in Granulosazellen (r = 0,76; p = 0,05), IL6 und PTX3 in Granulosazellen (r = 0,76;

p = 0,05), TNFA im Uterusepithel und IL6 in Granulosazellen (r = 0,76; p = 0,05), PTGS2 im Uterusepithel und in Kumuluszellen (r = - 0,79; p = 0,04), PTGS2 im Uterusepithel und PTX3 in Kumuluszellen (r = - 0,82; p = 0,02)

Innerhalb der Kontrollseite korrelierten folgende Werte: PTGS2 im Uterusepithel und TNFAIP6 im Epithel der UTV (r = 0,79; p = 0,04), TNFAIP6 im Epithel des Uterus und der UTV (r = 0,89; p = 0,01), TNFAIP6 in Granulosazellen und TNFA im Uterusepithel (r = 0,89; p = 0,01), PPARG1 in Granulosazellen und TNFAIP6 im Uterusepithel (r = 0,86; p = 0,01), IL6 in Granulosazellen und TNFAIP6 im Epithel der UTV (r = 0,78; p = 0,04); IL6 in Granulosazellen und PTGS2 im Epithel der UTV (r = 0,85; p = 0,01).

IL6 in Granulosazellen korrelierte sowohl auf der Seminalplasmaseite (r = 0,78; p = 0,04) als auch auf der Kontrollseite (r = 0,88; p = 0,01) mit TNFA im Epithel der UTV. Ebenso unabhängig von der Behandlung korrelierten PTGS2 und PTX3 in Granulosazellen und Kumuluszellen (Versuchsseite r = 0,86; p = 0,01; Kontrollseite r = 0,82;

p = 0,02).

Bei den relativen Expressionsstärken der Oozytentranskripte, die hohen tierindividuellen Schwankungen unterlagen, korrelierten die Seminalplasmaseiten zu ihren jeweiligen Kontrollseiten (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). Lediglich für ZAR1 konnte diese Korrelation nicht statistisch abgesichert werden (p > 0,05). Innerhalb der Oozytentranskripte konnten auf der mit Seminalplasma behandelten Seite sieben korrelative Zusammenhänge festgestellt werden (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04), während nur vier Transkriptepaare ausschließlich innerhalb der Kontrollseite korrelierten (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). Zusätzlich lagen für fünf Transkriptpaare Korrelationen auf beiden Seiten vor  (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). CyclinB1 (r = - 0,74; p = 0,06), CDK1 (r = - 0,88; p = 0,01), PCNA (r = - 0,79; p = 0,03), GDF9 (r = - 0,79; p = 0,03) und BMP15 (r = - 0,78; p = 0,04) waren nach Seminalplasmakontakt des ipsilateralen Uterushorns negativ zur Expressionsstärke von TNFAIP6 in den gleichseitigen Granulosazellen korreliert. Auf der Kontrollseite bestand lediglich eine Korrelation zwischen ZAR1 und IL6 in zugehörigen Granulosazellen (r = 0,85; p = 0,01).

Blutproben, die zu zwei Zeitpunkten aus dem peripheren Blutkreislauf entnommen worden waren, wiesen zum Zeitpunkt der Behandlung einen signifikant höheren Gesamtöstrogengehalt (p < 0,05) und somit  ein höheres Gesamtöstrogen – Progesteron – Verhältnis (p = 0,05) auf als 17 h später (Zeitpunkt der Probengewinnung).

Die Hypothese, dass intrauterin appliziertes Seminalplasma die Regulation immun- und follikelreifungsassoziierter Transkripte beeinflusst, konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden. Dabei steht 17 h nach Applikation die reduzierte Expression von PTGS2 im Uterusepithel im Vergleich zur Kontrollseite im Vordergrund.

Darüber hinaus geben korrelative Beziehungen Hinweise darauf, dass Seminalplasma die Kommunikation zwischen Granulosazellen und Oozyten sowie die Genexpression innerhalb der Oozyte reguliert.

Tenor der gegenwärtigen Literatur ist – und darin lässt sich das Ergebnis der vorliegenden Studie einordnen – dass die Immunantwort des Uterus auf Seminalplasma nicht länger ausschließlich als klassisch inflammatorisch angesehen werden kann. Im Seminalplasma scheinen immunsuppressive Komponenten enthalten zu sein, deren Wirkung in den ersten 24 h nach Besamung dominiert. Die Einbeziehung anderer aktueller Studien lässt auf eine zeitliche Dynamik der Seminalplasmawirkung schließen.

 

abstract (englisch)

The aim of the present study was to examine gene expression patterns of selected transcripts related to immune response and follicle maturation in the uterus and ovary of gilts in estrus after they had received an unilateral, intrauterine infusion of seminal plasma.

Using a surgical approach in an in vivo animal model, pooled, porcine seminal plasma was applied unilaterally into a ligated uterine horn. The contralateral horn was infused with PBS and served as a control.

The following samples were collected from seven gilts in spontaneous estrous 17 h after treatment: uterine epithelial cells, epithelial cells from the uterine part of the uterotubal junction, granulosa cells, cumulus cells and oocytes.

Gene expression was measured using RT – qPCR for six genes of interest: prostaglandin–endoperoxide synthase 2 (PTGS2), pentraxin 3 (PTX3), tumor necrosis factor alpha–induced protein 6 (TNFAIP6), tumor necrosis factor alpha (TNFA), interleukin 6 (IL6) and peroxisome proliferator–activated receptor gamma 1 (PPARG1). The expression of porcine ubiquitin B (UBB) was assessed as a potential reference gene. Unfortunately, its expression was too unstable to serve as a reference gene and therefore was used as positive control.

A different set of genes of interest was measured in the oocytes: c–mos, bone morphogenetic protein 15 (BMP15), growth differentiation factor 9 (GDF9), cyclin B1, cyclin–dependent kinase 1 (CDK1), mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and zygote arrest gene 1 (ZAR1).

Seventeen hours after contact to seminal plasma, uterine epithelium expressed significantly lower amounts of PTGS2 than after infusion of PBS (control; p < 0.05). Regarding all other examined cell types and genes of interest, seminal plasma did not induce a significant difference in gene expression compared to the control side

(p > 0.05).

Irrespective of the treatment (seminal plasma or PBS), expression of PTGS2, TNFA and TNFAIP6 was higher in epithelial cells from the uterus compared to epithelial cells from the ipsilateral uterotubal junction. All differences were significant (p < 0.05) except for TNFAIP6 at the seminal plasma-treated side (p = 0.08).

Significant correlations between the transcripts levels of several genes were found. Correlations within the seminal plasma-treated side of the genital tract were: PTGS2 and IL6 in granulosa cells (r = 0.76; p = 0.05), IL6 and PTX3 in granulosa cells (r = 0.76; p = 0.05), TNFA in uterine epithelium and IL6 in granulosa cells (r = 0.76; p = 0.05), PTGS2 in uterine epithelium and in cumulus cells (r = - 0.79; p = 0.04), PTGS2 in uterine epithelium and PTX3 in cumulus cells (r = - 0.82; p = 0.02)

Correlations within the control side of the genital tract were: PTGS2 in uterine epithelium and TNFAIP6 in epithelium of the uterotubal junction (r = 0.79; p = 0.04), TNFAIP6 in uterine epithelium and epithelium of the uterotubal junction (r = 0.89; p = 0.01), TNFAIP6 in granulosa cells and TNFA in uterine epithelium (r = 0.89; 

p = 0.01), PPARG1 in granulosa cells and TNFAIP6 in uterine epithelium (r = 0.86; p = 0.01), IL6 in granulosa cells and TNFAIP6 in epithelium of the uterotubal junction (r = 0.78; p = 0.04); IL6 in granulosa cells and PTGS2 in epithelium of uterotubal junction (r = 0.85; p = 0.01).

Independent from the treatment, expression levels of IL6 and TNFA in the epithelium of the uterotubal junction correlated after contact to seminal plasma (r = 0.78;

p = 0.04) as well as after contact to PBS (control; r = 0.88; p = 0.01). Similarly, PTGS2 and PTX3 correlated in granulosa cells as well as in cumulus cells independent from the treatment (seminal plasma: r = 0.86; p = 0.01; control: r = 0.82; p = 0.02).  

The relative expression of transcripts in the oocytes varied from gilt to gilt, but was correlated (r ≥ 0.79; p ≤ 0.04) between treated and control sides for all genes of interest but ZAR1 (p > 0.05).

Relative transcript levels of the oocytes specific transcripts showed high variations between gilts. Expression levels for seven transcripts correlated between the seminal plasma-treated and the control side (r ≥ 0,79; p ≤ 0,04). For ZAR1 no significant correlation between both sides was found. Seven correlations (r ≥ 0.79; p ≤ 0.04) existed among the oocyte specific transcripts only within the seminal plasma-treated side, whilst just four significant correlations between genes were present at the control side

(r ≥ 0.79; p ≤ 0.04). Additionally, five correlations between genes were found irrespective of the treatment (r ≥ 0.79; p ≤ 0.04).

After the uterine horn has had contact to seminal plasma, expression levels of cyclin B1 (r = - 0.74; p = 0.06), CDK1 (r = - 0.88; p = 0.01), PCNA (r = - 0.79; p = 0.03), GDF9 (r = - 0.79; p = 0.03) and BMP15 (r = - 0.78; p = 0.04) in the ipsilateral oocytes correlated negatively with expression of TNFAIP6 in the corresponding granulosa cells. On the control side, only the expression level of ZAR1 in the oocyte was correlated to IL6 expression in granulosa cells (r = 0.85; p = 0.01).

Peripheral blood samples, which were taken during the first and second surgery, contained a significantly higher amount of total estrogen (p < 0.05) and a higher estrogen to progesterone ratio (p < 0.05) at the time point of the first surgery.

In conclusion, the hypothesis that intrauterine application of seminal plasma may influence the expression of transcripts associated with immune response and follicle maturation was confirmed. The most important point is the reduced expression of PTGS2 in uterine epithelium cells 17 h after application of seminal plasma. Furthermore, several correlations indicate that seminal plasma may regulate the communication between granulosa cells and the oocyte and gene expression within the oocyte.

Current perception in literature is that the uterine immune reaction to seminal plasma can no longer be exclusively considered to be a classical inflammatory response, which is in agreement with the results of the present study. Seminal plasma seems to contain immunosuppressive constituents, whose effect is dominant within the first 24 h after insemination. In context with other recent studies, temporal dynamics of seminal plasma action can be assumed.

 

keywords

Seminalplasma, Sau, Immunreaktion; seminal plasma, sow, immune reaction

kb

1.986