Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ariane Neumann

Neutrophil extracellular traps (NETs): Mechanisms of NET induction, bacterial NET degradation and host protection against bacterial degradation

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105817

title (ger.)

Neutrophil extracellular traps (NETs): Mechanismen zur NET Bildung, bakteriell-vermittelte NET Degradation und Maßnahmen des Wirtes zum Schutz gegen Degradation durch Bakterien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/neumanna_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Antimikrobielle „neutrophil extracellular traps“ (NETs) wurden vor kurzem als ein neuer Mechanismus des angeborenen Immunsystems im Kampf gegen eindringende Pathogene beschrieben. Die Bildung von NETs kann durch mehrere Pathogene oder verschiedene pro-inflammatorische Mediatoren induziert werden. NETs bestehen aus einem DNA-Grundgerüst, assoziiert mit Histonen, Proteasen und antimikrobiellen Peptiden (AMPs). Nach der Entlassung in den extrazellulären Raum können Pathogene eingefangen und immobilisiert werden. Das Ziel dieser Arbeit war, Mechanismen zur Bildung von NETs, bakteriell-vermittelte Degradation der NETs sowie Maßnahmen des Wirtes zum Schutz gegen die Degradation durch Bakterien zu untersuchen.

            Zuerst wurden verschiedene Mechanismen zur Bildung von NETs untersucht. Dabei zeigte sich, dass das Cathelicidin LL-37 in der Lage ist, NETs zu induzieren. Dies war möglich in der Anwesenheit von Stimuli, wie Phorbol-myristat-actetat oder hitze-inaktivierten S. aureus, oder auch ohne weiteren Stimulus. Die Hydrophobizität des Peptids spielte dabei eine wichtige Rolle, denn es konnte gezeigt werden, dass hydrophobe Fragmente von LL-37 sowie das hydrophobe Peptid Polymyxin B ebenfalls in der Lage sind, NET Bildung zu induzieren. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass LL-37 zur Kernmembran wandert, den Kernmembranmarker Lamin-B-Rezeptor verdrängt und folglich zur Zerstörung der Kernmembran führt.

            Es wurde vermutet, dass die LL-37-vermittelte NETs Bildung mit der Lipidzusammensetzung der Membran im Zusammenhang steht. Antimikrobielle Peptide zeigen eine hohe Affinität zu Membranen mit niedrigem Cholesterolgehalt, wie zum Beispiel bakterielle Membranen. Daher wurde die Rolle von Cholesterol auf die NET Bildung untersucht. Das Entziehen von Cholesterol aus der neutrophilen Membran führte zum Freisetzen von dsDNA, sowie neutrophiler Elastase und anschließend zur Bildung von NETs. Auch die Depletierung von anderen Lipiden, wie Sphingomyelin führte zur NET Bildung. Es wurde vermutet, dass die Lipidmembranzusammensetzung wichtig für die NET Bildung ist.

            Verschiedene Pathogene haben Mechanismen entwickelt, dem Einfangen und Abtöten durch die NETs zu entgehen. Dies wurde bereits für einige Gram-positive wie S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, sowie Gram-negative wie V. cholerae gezeigt. Dennoch ist wenig über die Interaktion von NETs mit Gram-negativen, gastrointestinale Infektionen auslösenden Pathogenen, bekannt. Aus diesem Grund wurden drei Y. enterocolitca Stämme (Serotypen O:9, O:8 und O:3) in ihrer Wechselwirkung mit NETs untersucht. Alle drei Stämme waren in der Lage die NET Bildung bei frühen Inkubationszeitpunkten (0,5 bis 1 h) zu induzieren. Dennoch war nach 3 h Ko-Inkubation eine Degradation der NETs zu beobachten. Dieser Effekt war Magnesium- und Calzium-Ionen-abhängig, was darauf schließen lässt, dass eine Nuklease der relevante Faktor für Y. enterocolitica sein könnte, der NETs degradiert.

            Schließlich wurde untersucht, wie sich der Wirt gegen die Degradation durch bakterielle Nukleasen wehren kann. Das antimikrobielle Peptid LL-37 wurde in NETs nachgewiesen. Interessanterweise wurde gezeigt, dass LL-37 seine antimikrobielle Aktivität verliert, wenn es an DNA gebunden ist. In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, dass LL-37 in der Lage ist, NETs gegen die Degradation durch die Nuklease von S. aureus zu stabilisieren. Auch konnte LL-37 humane blut-abstammenden DNA, sowie Kälberthymus-DNA vor dem Abbau durch verschieden bakterielle Nukleasen schützen, wie zum Beispiel mikrokokkale Nuklease von S. aureus, EndA von S. pneumoniae sowie Nukleasen von drei Gruppe A Streptokokken. Dieser beschützende Effekt korrelierte mit dem kationischen Charakter des Peptids. Andere kationische Peptide, wie HNP-1 und hBD-3 waren ebenfalls in der Lage, DNA vor Nuklease-vermittelter Degradation zu beschützen.

abstract (englisch)

Antimicrobial neutrophil extracellular traps (NETs) were recently described as a novel mechanism of the innate immune system to fight against invading pathogens. The release of NETs can be stimulated by several pathogens or various pro-inflammatory mediators. They consist of a DNA backbone associated with histones, proteases and antimicrobial peptides (AMPs). Upon release into the extracellular space, pathogens can be entrapped and immobilised. The aim of this study was to investigate the mechanisms of NET induction, bacterial-mediated degradation and host protection against bacterial evasion.

            First, mechanisms that might lead to the formation of NETs were investigated. Here it was shown that the cathelicidin LL-37 is able to induce NET release. The peptide was able to trigger NET formation in the presence of other stimuli such as phorbol myristate acetate or heat-inactivated S. aureus as well as alone. The hydrophobicity of the peptide plays an important role in the NET-inducing phenotype, since it was demonstrated that hydrophobic fragments of LL-37 as well as hydrophobic peptide polymyxin B are also able to induce NET formation. Fluorescence microscopy showed that LL-37 migrates to the nuclear membrane and eliminates the lamin-B-receptor in the membrane, thereby leading to a disruption of the nuclear membrane.

            It was hypothesised that the LL-37-mediated NET formation by disruption of the nuclear membrane is correlated to the lipid composition of the membrane. Antimicrobial peptides show a high affinity to membranes with low cholesterol content, such as bacterial membranes. Therefore, the role of cholesterol in NET formation was investigated. The depletion of cholesterol from the neutrophil membrane led to release of dsDNA as well as neutrophil elastase and subsequent formation of NETs. Furthermore, the depletion of other lipids such as sphingomyelin also led to NET release. Thus, it was hypothesised that the lipid membrane composition is important in the formation of NET.

            Several pathogens have evolved mechanisms to evade the entrapment and killing by NETs. This has been reported for Gram-positive bacteria such as S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae as well as Gram-negative V. cholerae. However, little is known about the interaction of NETs and Gram-negative pathogens causing gastrointestinal infections. Therefore three Yersinia enterocolitica strains (serotypes O:9, O:8 and O:3) were analysed for their interactions with NETs. All three strains were able to induce NET formation in early time points (0.5 to 1 h) of co-incubation with neutrophils. Still, after 3 h of co-incubation a degradation of NETs by all three serotypes was observed. This effect was magnesium and calcium ion-dependent, suggesting a nuclease might be the relevant factor for Y. enterocolitica to evade NET-mediated entrapment.

            Finally, the host protection against degradation by bacterial nucleases was analysed. The antimicrobial peptide LL-37 is found within the NET fibres. Interestingly, it was reported that LL-37 loses its antimicrobial activity when bound to DNA. In the present study it was observed that LL-37 is able to stabilise NETs against degradation mediated by S. aureus nuclease. LL-37 also protected human blood-derived DNA as well as calf thymus DNA from degradation mediated by several bacterial nucleases, such as micrococcal nuclease from S. aureus, EndA from S. pneunomiae and nucleases from three group A streptococci. This protective effect correlated with the cationic character of the peptide. Other cationic peptides, like HNP-1 and hBD-3 were also able to protect DNA from nuclease-mediated degradation.

keywords

Neutrophile, antimikrobielle Peptide, Wirts-Erreger-Interaktion, neutrophil granulocytes, antimicrobial peptides, host pathogen interactions

kb

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