Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Maximilian Naujock

Modelling the neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis using induced pluripotent stem cells

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108346

title (ger.)

Induzierte pluripotente Stammzellmodelle der neurodegenerativen Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/naujockm_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen wie der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS) können induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) als in-vitro Krankheitsmodelle dienen. Was vor wenigen Jahren noch als abstrakte Idee galt, hat heute bereits breiten Einzug in die akademische und industriebezogene Forschung erhalten. Erst kürzlich gelang es unabhängigen Arbeitsgruppen wichtige Pathomechanismen der ALS zu modellieren um diese schließlich als pharmakologisches Ziel auszugeben und erfolgreich zu behandeln.

In dem ersten Teil der vorliegenden Dissertation wurde ein innovatives Differenzierungsprotokoll ausgearbeitet, das zuverlässig und reproduzierbar aus iPSC Motoneurone (MN) generiert. Aus Nabelschnurblut gewonnene iPSC wurden hierbei zu expandierbaren neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) prä-differenziert und anschließend zu funktionellen motorischen Nervenzellen spezifiziert um schließlich funktionell und molekular untersucht zu werden (NAUJOCK et al. 2014).

Für den zweiten Teil wurde diese Methode dann auf iPSC von ALS-Patienten mit Mutationen in dem Superoxid Dismutase 1 (SOD1) oder fused-in sarcoma (FUS) Gen angewandt. Patch-Clamp Messungen im whole-cell oder current-clamp Modus zeigten, dass MN beider Patientengruppen zwar über physiologische Basiseigenschaften im selben Maße wie MN der gesunden Probanden verfügen, sich jedoch maßgeblich hinsichtlich ihrer Erregbarkeit und spontanen Aktivität unterscheiden. Während eine Mehrheit der gesunden MN mit multiplen Aktionspotenzialen (AP) auf eine schrittweise Depolarisation reagierten und hoch-frequent spontanaktiv waren, war dies bei weitaus weniger FUS und SOD1 MN zu beobachten. Bei Betrachtung der spannungsabhängigen Natrium- und Kalium-Ionenkanäle fiel auf, dass die ALS-MN eine niedrigere Natrium/Kalium Ratio aufwiesen, die mitunter ursächlich für den eben beschriebenen hypoexzitablen Phänotypen sein könnte. In den ALS-Gruppen wurde zudem mittels quantitativer real-time PCR eine reduzierte Expression sämtlicher Natriumkanalsubtypen festgestellt sowie in den FUS MN eine Hochregulierung von Kaliumkanälen festgestellt, was den funktionellen Phänotypen weiter unterstreicht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die MN mit einem reversiblen Kaliumkanalblocker behandelt, dem zugelassenen Medikament 4-Aminopyridine (4AP), in der Hoffnung die Erregbarkeit sowie Aktivität der SOD1 und FUS MN zu erhöhen. Einhergehend mit neuen Erkenntnissen aus verwandten Untersuchungen (SAXENA et al. 2013; LEROY et al. 2014) könnte dieses Induzieren von Aktivität neuroprotektive Effekte haben, die folglich untersucht wurden. Die Inkubation von 4AP reduzierte nicht nur die Stressantwort des endoplasmischen retikulums (ER-Stress) sondern vermochte selbst die Caspaseaktivität, ein Vorbote des apoptotischen Zelltodes, zu verringern.

Zusammenfassend wurde ein möglicher Wirkstoff identifiziert, der das Potenzial hat durch das Induzieren von Aktivität MN vor zellulärem Stress zu schützen, was im direkten Widerspruch zu konventionellen Behandlungsmöglichkeiten steht. iPSC-basierte Krankheitsmodelle zeigen demnach einmal mehr ihr großes Potenzial in der Identifizierung neuer Wirkstoffe zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie die der ALS.

abstract (englisch)

For the study of functional deficiencies in neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patient-derived iPSC can be used as in-vitro disease models. What has been proposed as theoretical possibility several years ago has become relevant for academic and industrial research nowadays. Very recently, independent groups identified ALS-associated key pathologies as targets for the assessment of novel pharmacological treatments.

In the first part of the thesis project, we worked out an innovative differentiation protocol to specify human cord blood-derived induced pluripotent stem cells (hCBiPSC) into functional motor neurons (MN). First, we generated expandable neural precursor cells which enabled subsequent specification into mature MNs. Via immunocytochemical and molecular methods we identified MN identity and tested their functionality via path clamp recordings of passive membrane properties and via calcium imaging (NAUJOCK et al. 2014).

During the second part of this dissertation we applied the experience in differentiating iPSC into functional MNs to ALS patient-derived iPSC with mutations in the superoxide dismutase 1 (SOD1) or fused-in sarcoma (FUS) gene. During initial electrophysiological characterization we observed that both ALS-iPSC-derived MN-groups showed significantly less spontaneous activity and reduced excitability. As underlying mechanism of this hypoexcitability we identified imbalances in NaSAXENA et al. 2013 ; LEROY et al. 2014 ) we aimed to reduce cell stress via induction of activity. Incubation with 4AP indeed re-established neuronal excitability, reduced elevated endoplasmic reticulum stress levels of ALS MNs and decreased caspase activity. ++ + + /Kratios. In parallel, quantitative real-time PCR (qPCR) results backed up those functional data by showing markedly reduced levels in Nachannel expression in the SOD1 and FUS group as well as elevated levels of Kchannels in FUS ALS cells. Based upon these findings we designed a pharmacological strategy to reverse the observed phenotype in order to provide neuroprotection. With 4-Aminopyridine (4AP) we chose a FDA-approved reversible potassium channel blocker that has the capacity to increase the excitability of our hypoexcitable ALS MNs. SAXENA et al. 2013 ; LEROY et al. 2014 ) we aimed to reduce cell stress via induction of activity. Incubation with 4AP indeed re-established neuronal excitability, reduced elevated endoplasmic reticulum stress levels of ALS MNs and decreased caspase activity. Since there is accumulating evidence that the induction of activity that could rescue ALS MNs from neurodegeneration (SAXENA et al. 2013 ; LEROY et al. 2014 ) we aimed to reduce cell stress via induction of activity. Incubation with 4AP indeed re-established neuronal excitability, reduced elevated endoplasmic reticulum stress levels of ALS MNs and decreased caspase activity.

The present dissertation project has therefore identified a novel therapeutic approach with the potential to rescue cells via the induction of activity, a concept that stands in direct contrast to conventional treatment options. Our studies support the usefulness of iPSC based disease models in the exploration and discovery of new potential therapeutic strategies for neurodegenerative diseases such as ALS.

keywords

Induzierte pluripotente Stammzellen, Amyotrophe Lateralsklerose, 4-Aminopyridin, induced pluripotent stem cells, amyotrophic lateral sclerosis, 4-Aminopyridine

kb

569