Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 Katharina Narten

 

Freeze- drying of equine sperm

and sperm chromatin structure during dried storage

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110040

title (ger.)

Gefriertrocknung von Hengstsperma und Spermienchromatinstruktur während der Lagerung

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/nartenk_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Nach der Gefriertrocknung von Sperma sind die Spermien devital und nicht mehr motil. Dennoch kann die Chromatinstruktur erhalten und die Spermien via intrazytoplasmatischer Spermieninjektion in eine Oozyte übertragen werden und zur erfolgreichen Befruchtung führen. Darüber hinaus ist die Lagerung und der Transport im gefriergetrockneten Zustand bei Umgebungstemperaturen, 4°C oder auch −20°C vorteilhaft, da kein Stickstoff und kein teures Aufbewahrungs-/Transportbehältnis benötigt wird. Für die erfolgreiche Gefriertrocknung werden protektive Agenzien, welche die biomolekulare Struktur während des Einfrierens und des Trocknens schützen, benötigt. Zucker werden häufig für die Gefriertrocknung verwendet, da sie als gute „Glasbildner" bekannt sind und im getrockneten Zustand Wassermoleküle ersetzen können.

            Das Ziel dieser Arbeit war es, die Spermienchromatinstruktur und -stabilität nach dem Gefriertrocknen und der Trockenlagerung zu bestimmen. Besonderer Schwerpunkt lag dabei im Vergleich verschiedener Formulierungen, die Zucker (Glukose, Saccharose, Trehalose) und Proteine (BSA, INRA-82) beinhalteten. Zudem wurden unterschiedliche Analyseverfahren zur Bestimmung der Chromatinstruktur und DNA- Schädigung verglichen. Das Überleben der Spermien wurde nach dem Einfrieren sowie nach der Gefriertrocknung ermittelt. Um die Alterung zu beschleunigen, wurde die Lagerung bei 37°C durchgeführt und die Chromatinstruktur nach drei Tagen bei hydratisierter Lagerung und nach drei Monaten Trockenlagerung ermittelt. Es wurde festgestellt, dass im Verlauf der dreitägigen hydratisierten Lagerung die Chromatinstruktur schnell degradiert, wohingegen nach Gefriertrocknung die Chromatinstruktur intakt bleibt. Vor allem bei Verwendung von Formulierungen aus TRIS+ gepufferten Salzlösungen mit chelatbildenden Verbindungen (EDTA), Disacchariden (d.h. Saccharose, Trehalose) und Albumin (z.B. Saccharose/ BSA Mixturen in einem 1/1 Massenverhältnis, jedes bei 1.71%) konnte die Spermienchromatinstruktur während der Trockenlagerung bis zu drei Monaten erhalten werden. Diese Formulierungskomponenten beeinflussen wahrscheinlich die Bildung einer „glasartigen“ Zellmatrix und den Wasseraustausch und ermöglichen dadurch einen Schutz der Spermienchromatinstruktur während der Trockenlagerung.

            Die DNA- Integrität wurde mit Hilfe des Spermien-Chromatin-Struktur-Assay (SCSA) ermittelt; dieses Verfahren beruht auf Säuredenaturierung und flowzytometrischer Analyse Acridine Orange–gefärbter Spermien zur Unterscheidung intakter und geschädigter DNA. Außerdem wurde der Spermien-Chromatin-Dispersions-Test (SCD) und die Einzel- Zell-Gel-Elektrophorese (Single cell gel electrophoresis, SCGE) durchgeführt. Dabei wurde herausgefunden, dass alle drei Verfahren zur Quantifizierung von DNA- Schädigung verwendet werden können. Hierbei korrelierte in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer bei 37°C eine reduzierte DNA-Integrität mit einem Anstieg des DNA-Fragmentations-Indexes ermittelt mittels SCSA, sowie reduzierten Halo- Größen (SCD) und einem Anstieg der Cometen-Schwanz Länge (SCGE).

abstract (englisch)

Freeze drying of sperm does not result in viable motile sperm. However, if chromatin structure is preserved, sperm can be used for intracytoplasmic sperm injection (ISCI) and fertilization of an oocyte. Moreover, storage and transport in the dried state at ambient conditions (i.e. room temperature), 4°C or even −20°C, is advantageous since it would eliminate the need of liquid nitrogen and special containers. For freeze drying, protective agents are needed that preserve biomolecular structure during both freezing and drying. Sugars, are often used for freeze-drying; since they have good glass forming properties and the ability to replace water in the dried state.

            The aim of the current study was to evaluate stallion sperm chromatin structure after freeze drying and during dried storage. Special emphasis was on the use of formulations containing sugars (glucose, sucrose, trehalose) and proteins (BSA, INRA-82), as well as different assays for evaluating sperm chromatin structure and DNA damage. Sperm survival was studied after cryopreservation as well as freeze drying. Storage was done at 37°C to accelerate aging, and chromatin structure was evaluated after hydrated and dried storage for up to 3 days and 3 months, respectively. It was found that chromatin structure rapidly degraded during hydrated storage during 3 d. Whereas, after freeze drying, chromatin structure was preserved. Especially using formulations composed of TRIS-buffered saline with chelator (EDTA), disaccharides (i.e. sucose, trehalose) and albumin (e.g. sucrose/BSA mixtures at a 1/1 mass ratio; 1.71% each), chromatin structure could be preserved during dried storage for up to 3 months. These compounds may play a role in formation of a glassy matrix and water replacement for protecting sperm chromatin during dried storage.

            DNA damage was analyzed using the sperm chromatin structure assay (SCSA), which involves acid denaturation and flow cytometric analysis of acridine orange stained sperm for discriminating between intact and damaged DNA. Furthermore, the sperm chromatin dispersion test (SCD), and single cell gel electrophoresis (SCGE) were performed. It was found that all assays can be used to quantify DNA damage. In dependence to the storage time at 37°C, the decreased chromatin integrity correlated with increased DFI-values with SCSA, decreased halo-sizes with SCD, and increased comet tail lengths with SCGE.

keywords

equine sperm, freeze- drying, chromatin structure/ Equine Spermien, Gefriertrocknung, Chromatinstruktur  

kb

2.421