Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Claudia Mroz

Seroprevalence of Rift Valley fever virus specific antibodies in livestock in Egypt and expression studies of virus related proteins in mammalian and arthropod cells

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110802

title (eng.)

Seroprävalenz von Rift Valley Fieber Virus spezifischen Antikörpern in Nutztieren in Ägypten, sowie Expressionsstudien von Virusproteinen in Säuger- und Insektenzellen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/mrozc_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Rift Valley Fieber Virus, ein Phlebovirus innerhalb der Familie Phenuiviridae verursacht schwere Ausbrüche sowie große Epidemien in vielen afrikanischen Ländern bei denen insbesondere Menschen, Wiederkäuer und Kamele betroffen sind. Das Virus wurde im Jahr 1977 nach Ägypten eingeschleppt, wo es eine massive Epidemie mit tausenden infizierten Menschen, vielen Verlusten innerhalb der Nutztierpopulation und großen ökonomischen Einbußen verursachte. Bis jetzt gilt diese Epidemie als eine der größten in der afrikanischen Geschichte. Nach einer langen inter-epidemischen Phase trat das Rift Valley Fieber erneut 1993 im ägyptischen Nildelta auf; weitere Ausbrüche folgten 1994, 1997 und zuletzt 2003. Die Ursachen der verschiedenen Ausbrüche, sowie das langfristige Überdauern des Virus während der inter-epidemischen Phasen, in denen das Virus auf niedrigem Level zwischen Mücken und Wildwiederkäuern zirkuliert, sind nicht gänzlich bekannt.

 

Seroepidemiologische Studien sind nützlich, um den aktuellen Antikörperstatus von nicht-immunisierten Tieren in verschiedenen Regionen zu beobachten. Außerdem können diese Untersuchungen zu einer epidemiologischen Risikoanalyse beitragen, um die aktuelle Gefahr erneuter Rift Valley Fieber Ausbrüche zu evaluieren. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, 873 Feldseren von nicht immunisierten Tieren, bestehend aus Schafen, Ziegen, Büffeln und Kamelen aus verschiedenen ägyptischen Gouvernements auf das Vorhandensein von anti-RVFV Antikörpern serologisch mittels kommerziellen ELISA, Virusneutralisationstest und indirekter Immunfluoreszenz zu untersuchen. Diese Untersuchung zeigte in erster Linie ein niedriges Antikörpervorkommen von 2,3 Prozent in den untersuchten Tieren, ohne jegliche Anzeichen akuter Infektionen. Die höchste Prävalenz von 9,9 Prozent wurde bei Kamelen aus einem Schlachthof in der Nähe von Kairo detektiert. Darüber hinaus wurde in einer weiteren Studie von 1.349 Seren nicht-immunisierter Rinder eine Seroprävalenz von 7,9 Prozent festgestellt. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf eine geringe Virusverbreitung innerhalb der aktuellen interepidemischen Phase hin, folglich aber auch auf das Vorhandensein des Virus im ägyptischen Nildelta. Zusätzlich unterstreichen diese Resultate die bedeutende Rolle von Boviden und Kameliden im RVFV-Vermehrungszyklus in Ägypten. Vermutlich ist die Viruspersistenz und das potenzielle aktive Auftreten des RVFV im Land erst durch das Vorhandensein nicht geimpfter, empfänglicher Tiere in Kombination mit günstigen Bedingungen für die Mückenvermehrung möglich. Aus diesem Grund wurde in Ägypten ein für Afrika und weltweit einzigartiges Impfprogramm etabliert. Demnach sollen alle empfänglichen Tiere zweimal im Jahr mit einem lokal produzierten, inaktiven anti-RVFV-Impfstoff geimpft werden. Auch wenn dieses Programm bereits 1980 eingeführt wurde, sind nur wenige Informationen bezüglich der Effektivität der Impfung und der verbundenen Serokonversion der immunisierten Nutztiere verfügbar. Vor diesem Hintergrund führten wir eine vergleichende Studie von immunisierten und nicht-immunisierten Milchkühen aus vier Gouvernements im Nildelta durch. Es wurden 2.818 Rinderseren aus 26 verschiedenen Farmen, die an dem offiziellen Impfprogramm teilnehmen im Vergleich zu 1.349 Rinderseren aus 27 Kleinsthaltungen ohne Impfprogramm gegen RVFV analysiert. Die serologischen Testungen wurden in einem drei-stufigen Ansatz durchgeführt. Nach Untersuchung mit einem kommerziellen ELISA folgten Bestätigungstests bei positiven und fraglichen Resultaten mittels Virusneutralisations- und Immunfluoreszenztest. Überraschenderweise zeigten die Ergebnisse bei den immunisierten Rindern mit nur 15 Prozent eine geringe Seroprävalenz, die nicht signifikant höher war als die Prävalenz der nicht geimpften Tiere (7,9%). Darüber hinaus konnten wir große Unterschiede in der Seroprävalenz zwischen den einzelnen Farmen feststellen. Derartige inadäquate Impflevel in Verbindung mit fehlenden DIVA-Vakzinen kehren den nutzbringenden Effekt eines Impfprogramms um und erwecken ernste Bedenken bezüglich des ägyptischen Gesundheitsmanagements von Mensch und Tier. Eine erneute Evaluierung des Impfprogramms in Ägypten ist demzufolge dringend anzuraten.

 

Ein Verständnis der RVFV-Ausbruchsgeschehen setzt neben Kenntnissen über die Virusvermehrung in den empfänglichen Tieren auch eine Kenntnis der Virusvermehrung in den Mückenvektoren voraus. In beiden Fällen sollten die Nicht-Strukturproteine NSs und NSm Beachtung finden, die die Hauptvirulenzfaktoren des Virus darstellen. Das NSs und NSm Protein manipulieren die Immunabwehr von Wirtzellen der Säugetiere mittels einer Beeinträchtigung der Interferon-Antwort beziehungsweise mit der Inhibition der virusinduzierten Apoptose von infizierten Zellen. Die Bedeutung in der Amplifikation und Persistenz in den Mücken ist jedoch weitestgehend unbekannt.

 

Aus diesem Grund war die vergleichende Infektionsstudie mit dem RVF-Impfstamm MP12, in der die Proteinexpression in Säugetier- und Arthropodenzellen verfolgt wurde, ein weiterer Teil dieser Arbeit. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen die beiden Nicht-Strukturproteine generiert und für den Einsatz in der Immunfluoreszenz und im Western Blot validiert. Die Expressionsstudie wurde durch monoklonale Antikörper gegen das Nukleokapsidprotein und die beiden Glykoproteine komplettiert. Dadurch bestand die Möglichkeit, fünf verschiedene virale Proteine während der Infektion von Vero 76 und C6/36 Zellen zu verfolgen. Zytopathische Effekte wurden nur bei den Vero-Zellen beobachtet, ebenso zeigten nur die Säugetierzellen die auf das NSs Protein basierenden filamentösen Strukturen in den Zellkernen. Im Gegensatz dazu befand sich das NSs Protein im gesamten Zytoplasma der Mückenzellen verteilt und formte kleine Punkte nach einer Infektionszeit von 72 Stunden. Des Weiteren wird durch die vermehrte Expression des NSm Proteins in den C6/36 Zellen im Vergleich zu den Vero-Zellen die Relevanz dieses Proteins in den Mückenzellen hervorgehoben. Diese Ergebnisse geben weitere Hinweise für die unterschiedliche Rolle von NSs während der Replikation in Säugetier- im Vergleich zur Mückenzelle und verdeutlichen die unterschiedlichen anti-viralen Bekämpfungsstrategien.

 

Insgesamt unterstützen die vorliegenden Ergebnisse aus den serologischen Analysen der ägyptischen Nutztiere die These einer momentan geringen Viruszirkulation im Nildelta. Die defizitäre Serokonversion geimpfter Rinder unterstreicht jedoch die Notwendigkeit einer erneuten Evaluation des Impfprogrammes in Ägypten. Die in dieser Arbeit beschriebene Expressionskinetik der RVFV assoziierten Proteine ermöglicht außerdem zum ersten Mal den Vergleich der fünf Proteine des RVFV und gibt damit weitere Hinweise auf die besonderen Rollen der Nicht-Strukturproteine in Vektor- und Wirtszelle.

abstract (englisch)

Rift Valley fever virus, a Phlebovirus of the family Phenuiviridae consistently causes severe outbreaks and large epidemics in many African countries affecting humans, ruminants and camels. The virus was introduced into Egypt in 1977 and caused an extensive epidemic with thousands of infected humans, high mortality rates in livestock and high economic losses. Up to now, this has been considered as one of the largest epidemics in the RVF history in Africa. After a long inter-epidemic period, the RVF re-occurred in the Nile Delta of Egypt in 1993 with subsequent outbreaks in 1994, 1997 and, most recently, in 2003. The causes of the different outbreaks, as well as the maintenance of the virus during inter-epidemic periods, in which the virus circulates at a low level between mosquito vectors and wild ruminants, are not entirely known.

 

Seroepidemiological studies are useful tools to monitor the current antibody status in non-immunized livestock in different areas. Moreover, these examinations can provide an epidemiological risk assessment to evaluate the potential threat of new RVF outbreaks. Therefore, as one objective of this thesis, 873 field serum samples of non-immunized animals including sheep, goats, buffalos and camels from different Egyptian governorates were checked for the presence of anti-RVFV antibodies using a serological approach, including a commercial ELISA, virus neutralization test and indirect immunofluorescence assay. The main finding in this analysis was a low antibody presence of 2.3 per cent in the investigated animals without any signs of an acute infection. The highest prevalence of about 9.9 per cent was detected in camels from an abattoir near Cairo. Moreover, an additional analysis of 1,349 non-immunized cattle sera displayed a seroprevalence of about 7.9 per cent. All in all, the results indicate a low level of virus transmission during the current inter-epidemic period and consequently, the maintenance of the virus in the Nile Delta of Egypt. In addition, these results underline the important role of bovines and camels in the amplification cycle of RVFV in Egypt. It has been suggested that the presence of unvaccinated susceptible livestock combined with favorable conditions for the breeding of mosquitos facilitates the persistence and potential emergence of RVFV in the country. That is why a vaccination program was implemented in Egypt, which is unique in Africa and even world-wide. According to this program every susceptible livestock has to be vaccinated twice a year with a locally produced inactivated anti-RVFV vaccine. Although this program was already established in 1980, there is little information about the effectiveness of the vaccination and the subsequent seroconversion in immunized livestock. On account of this, a further aim of this thesis was a comparative serological survey of immunized and non-immunized dairy cattle from four Nile Delta governorates. Analysis of 2,818 cattle sera from 26 different farms that had participated in the official vaccination program were compared to 1,349 cattle-derived sera from 27 small holdings without any vaccination against RVFV. The serological testing was carried out in a three-step approach, including a commercial ELISA followed by the re-assessment of positive and questionable results by virus neutralization test and indirect immunofluorescence assay. Surprisingly, the results demonstrated a low seroprevalence of about 15 per cent in immunized cattle, which was not significantly higher than those in non-vaccinated animals (7.9 per cent). In addition, we could determine highly divergent seroprevalence rates between individual farms. Such inadequate levels of immunization in conjunction with the lack of DIVA vaccines oppose the beneficial effects of the vaccination program and raise serious concerns about public and animal health policies in Egypt. As a result, re-evaluation of this vaccination program is highly recommended.

 

In order to understand RVFV occurrence, information about virus amplification in susceptible hosts as well as information about the replication in mosquito vectors must be present. In both cases attention must be paid to the role of the nonstructural proteins NSs and NSm, which are the main virulence factors of the virus. NSs and NSm protein manipulate the mammalian host cell immune defense by deranging the interferon response and, respectively, by inhibiting the virus induced apoptosis of the infected cells. However, their impact in mosquito related amplification and persistence is largely unknown.

 

Therefore, another part of this thesis was a comparative infection study with RVFV-vaccine strain MP12 to monitor the protein expression in mammalian as wells as in arthropod cells. For this purpose, monoclonal antibodies against both nonstructural proteins were generated and validated for their application in immunofluorescence and Western Blot analysis. The study was complemented by monoclonal antibodies against the nucleocapsid protein and the two glycoproteins which allowed us to follow the expression kinetics of five different viral proteins during infection of Vero and C6/36 cells. Cytopathic effects could only be monitored in Vero cells, accompanied by NSs derived filamentous structures solely within the mammalian nucleus. Contrary, NSs was distributed throughout the mosquito cell cytoplasm and formed small dots within the nucleus 72 hours post infection. Furthermore, the elevated expression level of the NSm protein in C6/36 cells compared to Vero cells highlights the mosquito related relevance of this protein. These findings provide additional evidence for a divergent role of NSs and NSm during replication in the mammalian host compared to the mosquito vector and highlight different antiviral defense strategies.

 

All in all, the present findings of the serological analysis of Egyptian livestock confirm an ongoing low level of RVFV circulation in the Egyptian Nile Delta. However, the significant deficiency of seroconversion in cattle highlights the necessity to re-evaluate the vaccination program. In addition, the expression kinetic of RVFV related proteins described here allow for the first time the comparison of five RVFV proteins and provides an insight into the different roles of the nonstructural proteins in vector and host cell.

keywords

Rift Valley Fieber Virus, Ägypten, Seroprävalenz, Rift Valley fever virus, Egypt, Seroprevalence

kb

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