Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Mohammed Moulay

Expression of stem cell marker genes in canine prostate cancer cell lines as basis for the development of molecular therapeutic tools

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95- 105789

title (ger.)

Expression von Stammzellmarker-Gene in canine Prostatakrebs-Zelllinien als Grundlage für die Entwicklung von Molekular therapeutischen Ansätzen 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/moulaym_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Der häufigste Tumor bei Männern weltweit ist das Prostatakarzinom. Aggressive Formen, die zu Rezidiven und zur Metastasierung neigen, sind schwer zu behandeln und führen früher oder später zum Tode. Dies ist Anlass, nach neuen Behandlungsformen zu suchen.

Der Hund ist das einzige Tier, bei dem spontan Prostatatumoren auftreten, weshalb diese Spezies als ein natürliches Tiermodell für das menschliche Prostatakarzinom zunehmend in den Mittelpunkt des Interesses rückt. Auch haben Tumore des Hundes und das so genannte Kastrations-resistente Prostatakarzinom beim Mensch viele Ähnlichkeiten: beide sind kastrationsresistent, zeigen eine ausgeprägte Metastasierungstendenz vor allem in den Knochen, und es gibt Hinweise auf ihre Abkunft von basalen Zellen des Prostataepithels.

Wie bei einer Reihe anderer Tumoren geht man nach heutiger wissenschaftlicher Erkenntnis davon aus, dass Krebsstammzellen, bzw. Tumor-initiierende Zellen, eine zentrale Rolle bei der Initiation, Progression, Metastasierung und Therapieresistenz des Prostatakarzinoms spielen. Die Existenz solcher Krebsstammzellen wurde für menschliche Prostatatumoren bereits bewiesen, der endgültige Nachweis für den Hund steht jedoch bislang noch aus.

In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Zellinien, die aus Neoplasien der Prostata von Hunden etabliert wurden, im Hinblick auf das Vorhandensein möglicher Krebsstammzellen untersucht. Dazu wurden verschiedene Eigenschaften, die auf einen Stammzellcharakter hinweisen analysiert, und zwar die Expression mehrerer Oberflächenantigene sowie diverser Gene, die als potenzielle Marker für CSC angesehen werden.

Die untersuchten Zelllinien waren: CT1258 (Adenokarzinom der Prostata), zwei Tochterzelllinien, die stabil transfiziert waren zum einen mit einem Expressionsvektor für EGFP, zum anderen mit einem EGFP-HMGA2-Fusionsprotein, ferner DT08/40 aus einem Übergangszellkarzinom sowie DT08/46 aus einer Prostatazyste. Mittels Durchflusszytometrie, konventioneller und qPCR wurde die Expression von CD34, CD44, CD133, C-KIT, ITGA6, C-MYC, NANOG, DDS5, KLF4, SOB2, MELK und OCT4 untersucht.

 

In einer zweiten Studie wurden adhärente CT1258-Zellen serumfrei kultiviert, um eine Anreicherung von Zellen, die als Sphäroide wachsen zu erreichen, einer typischen Eigenschaft von Krebsstammzellen. Die Genexpressionsprofile der erhaltenen Sphäroide wurden ebenfalls analysiert und mit denen der Ausgangszellen verglichen.

 

Während CD44 in allen untersuchten Zelllinien stark exprimiert wurde, konnte für CD133 lediglich eine schwache Expression in den beiden transfizierten Linien nachgewiesen werden, für die parentale Linie CT1258 sowie die beiden anderen Zelllinien jedoch keine Expression. Eine schwache Expression von ITGA6, MELK und DDX5 fand sich in fast allen Linien, mit Ausnahme der transfizierten Linien, in denen die Expression sehr schwach war. Dies galt auch für OCT4 in allen untersuchten Linien.

Der Vergleich von adhärenten und in Sphäroiden wachsenden Zellen zeigte eine Tendenz zu geringerer Expression aller Marker in den Sphäroiden, mit Ausnahme von ITGA6, das deutlich stärker in den Sphäroiden exprimiert wurde.

Zusammengefasst konnte ein charakteristisches Markerprofil für jede der untersuchten Linien beschrieben werden. Auch war es möglich, aus der Prostatakarzinomzelllinie CT1258 Sphäroide zu generieren. Der Vergleich der Markerprofile zwischen adhärenten und sphäroiden Zellen zeigte unterschiedliche Expressionsmuster von ITGA6 und C-MYC. Der Vergleich der analysierten Gene ergab ein charakteristisches Muster für jede Zelllinie sowie auch die Anreicherung einer Zellpopulation innerhalb der Sphäroidzellen, bei der es sich möglicherweise um Krebsstammzellen handelt.

 

abstract (englisch)

Prostate carcinoma is the most frequent cancer affecting men worldwide. Because aggressive carcinomas, characterized by metastasis and recurrence, are difficult to treat and eventually lead to death, new strategies for curative therapies are sought. The dog is the only animal that spontaneously develops prostate cancer, a fact that has drawn more and more attention to the possible use of this canine disease as a naturally occurring animal model for human prostate cancer. Moreover, the canine tumor resembles very much the aggressive, metastatic prostate carcinoma in man in the sense that both are castration-resistant, tend to metastasize early and predominantly to the skeleton and are thought to be derived from the basal layers of the prostatic epithelium.

Like in various other cancer types, cancer stem cells or tumor-initiating cells, respectively, are thought to play a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis and therapy resistance. For prostate carcinoma, their existence has been proven for man, but hitherto not in the dog.

In the presented thesis, several cell lines derived from benign as well as malignant canine prostate neoplasias were investigated with regard to possible stem-cell like properties, such as expression of certain surface antigens and genes thought to be potential markers of CSC.

The cell lines investigated were: CT1258, established from a canine prostate adenocarcinoma, two derivatives of this line stably transfected with either an expression vector encoding for EGFP or EGFP-HMGA2 fusion protein, DT08/40 from a transitional cell carcinoma of the prostate and DT08/46 from a prostate cyst. Markers analysed by flow cytometry, PCR and qPCR, respectively, were CD34, CD44, CD133, C-KIT, ITGA6, C-MYC, NANOG, DDX5, KLF4, SOX2, MELK and OCT4.

Moreover, cultivated CT1258 cells were transferred to serum-free culture conditions in order to enrich cells able to grow in spherical form, a typical property of CSCs. Spheroid cells were then analyzed for gene expression profiles and surface antigens mentioned above in comparison to the parental, adherent cells.

Whereas CD44 was strongly expressed in all cell lines analyzed, only weak expression of CD133 could be demonstrated in the two transfected cell lines, but neither in the parental line CT1258 nor in the two other lines. Weak expression of ITGA6, MELK and DDX5 was found in almost all cell lines, with the exception of the transfected lines, where expression was very weak. This was also the case for OCT4 in all lines.

Comparison of adherent and spheroid cells revealed a tendency to lower expression of all markers in the spheroidal cells, with the exception of ITGA6, which was distinctly higher in the spheroids.

In conclusion, a characteristic marker expression profile was found for each analyzed cell line. Also, spheres could successfully be generated from the prostate carcinoma cell line CT1258. Comparison of the markers between adherent and spheroidal cells showed different expression of ITGA6 and C-MYC. The description of the analyzed genes shows a characteristic pattern for each cell line and also the presence of a specifically enriched cell population in the spheroidal cells, which might be indicative of the presence of cancer stem cells.

 

keywords

Canines Prostata Karzinom, CSC, Suspension System 

kb

18.288