Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ann-Kathrin Mork

 

 Vergleichende Analyse von aviären Coronavirusstämmen in primären Hühnerovidukt Zellkultursystemen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106696

title (engl.)

Comparative Analysis of differtent avian coronavirus strains in primary chicken oviduct cell culture systems

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/morka_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Das hochkontagiöse aviäre Coronavirus (AvCoV) führt als einer der bedeutendsten Krankheitserreger in der Geflügelindustrie immer wieder zu großen wirtschaftlichen Verlusten. Eine Infektion mit dem AvCoV äußert sich vor allem durch Schädigungen im Respirationstrakt, in den Nieren und im Legeapparat. Obwohl es wirksame Impfstrategien gibt, spielen Infektionen mit dem Aviären Coronavirus in den Geflügelbeständen nach wie vor eine große Rolle, da das Vorkommen von neuen Virusvarianten und die nicht vorhandene Kreuzprotektivität der vorhandenen Impfstoffe, einen vollständigen Schutz gegen das Virus schwierig macht.

Der Grund für den unterschiedlichen Organ-Tropismus verschiedener AvCoV-Stämme ist noch nicht genau bekannt. In dieser Arbeit wurde die Expression von Sialinsäuren in den verschiedenen Segmenten des Ovidukts mit der Empfänglichkeit der Epithelzellen des Ovidukts für eine Infektion mit den AvCoV-Stämmen QX, B1648 und Beaudette verglichen. Dazu wurden ein Ovidukt-Organkultursystem mit dem Ovidukt juveniler Tiere und ein primäres Zellkultursystem mit isolierten chicken oviduct epithelial cells (COEC) adulter Tiere, etabliert. Eine Färbung der Epithelzellen des Ovidukts mit dem Lektin von Maackia amurensis agglutinin II (MAAII) zum Nachweis alpha 2,3-gebundener Sialinsäuren und mit dem Lektin von Sambucus nigra agglutinin (SNA), zum Nachweis alpha 2,6-gebundener Sialinsäuren ergab, dass beide Verknüpfungsarten entlang des Ovidukts exprimiert werden, alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren aber auf den Zielzellen vorherrschen. Die Infektion der unterschiedlichen Segmente des Ovidukts hat ergeben, dass der AvCoV-Stamm QX alle Segmente des Ovidukts effizient infizieren kann. Dementgegen konnte nur vereinzelt Virusantigen im Infundibulum mit dem nephropathogenen Stamm B1648 nachgewiesen werden. Durch die Bindung des viralen Spike-Proteins an einen Rezeptor auf der Zelloberfläche wird der Viruseintritt in Wirtszellen vermittelt. Für das AvCoV sind alpha 2,3-gebundene Sialinsäuren als Rezeptordeterminante beschrieben worden. Um zu untersuchen, ob der unterschiedliche Gewebetropismus der AvCoV-Stämme mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften der S-Proteine erklärt werden kann, wurden Bindungsversuche mit löslichen S1-Proteinen der AvCoV-Stämme QX und B1648 auf COEC durchgeführt. Die löslichen S1-Proteine sowohl des pathogenen QX-Stammes, als auch des nephropathogenen B1648-Stammes konnten in allen Segmenten des Ovidukts binden. Das Entfernen der Sialinsäuren von der Zelloberfläche durch die Behandlung der Zielzellen mit dem Enzym Neuraminidase führte dazu, dass sowohl der QX-Stamm, als auch der B1648-Stamm in ihrer Infektion und auch in der Bindung ihrer löslichen S1-Protein deutlich beeinträchtigt waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sialinsäuren eine wichtige Rolle für die Infektion und die Bindung der löslichen Spike-Proteine der untersuchten AvCoV-Stämme spielen. Dennoch kann der unterschiedliche Gewebe-Tropismus der beiden Stämme nicht mit den Sialinsäurebindungseigenschaften ihrer Spike-Proteine erklärt werden.

In dieser Arbeit wurden zwei Kultursysteme mit enddifferenzierten Epithelzellen, ein Ovidukt-Organkulturen-System und ein Zellkultursystem mit primären, isolierten COEC, etabliert, die sich bei künftigen Arbeiten als interessante Hilfsmittel erweisen können, um die Infektion des Ovidukts durch das AvCoV genauer zu untersuchen.

abstract (englisch)

The avian coronavirus (AvCoV) is a major poultry pathogen. The economic importance of the disease for layer flocks is tremendous, because the virus does not only replicate in the epithelium of the respiratory tract or the kidneys, some strains can also lead to pathological alterations in the oviduct. Reasons for differences in the tissue tropism and pathogenicity between different AvCoV strains, are still an open question.

A characteristic feature of AvCoV is the occurrence of many different strains belonging to different serotypes, which makes a complete control of the disease by vaccinations a challenging task.

In this study, the expression of sialic acids in the different segments of the oviduct was investigated. It was analyzed, if there are differences in the susceptibility of the epithelial cells of the Infundibulum, Isthmus, Magnum, and Uterus parts of the oviduct to an infection with the AvCoV strains QX, B1648 and Beaudette. For this purpose, two primary chicken culture systems, an oviduct-organ culture system of the juvenile oviduct and a primary cell culture system of isolated chicken oviduct epithelial cells (COEC) of adult animals were established. Lectin staining of the sensitive cells in the different segments of the oviduct with the lectin maackia amurensis agglutinin II (MAAII), to detect alpha 2,3-linked sialic acids and with the lectin sambucus nigra agglutinin SNA to detect alpha 2,6-linked sialic acids showed that both linkage types of sialic acids are expressed on the target cells, but alpha 2,3-linked sialic acids were abundantly expressed. Infection of the epithelial cells of the oviduct showed a high susceptibility to infection by the QX strain and were almost resistant to infection by the nephropathogenic B1648 strain. As the viral entry into host cells is mediated by binding of the viral S protein to a receptor on the cell surface, and alpha 2,3-linked sialic acids have been shown to serve as a receptor determinant for AvCoV, it was investigated, if the different tissue tropism of the analyzed strains can be explained with the different binding properties of their spike proteins. Binding tests with isolated primary oviduct epithelial cells and soluble S1 proteins revealed that S1 proteins of two IBV strains bound with the same efficiency to oviduct epithelial cells. A treatment of the cells with the enzyme neuraminidase to remove sialic acids from the surface of the target cells, affected the infection and the binding of the analyzed AvCoV strains. This attachment was sialic acid dependent, indicating that the sugar binding property of AvCoV spike proteins is not the limiting factor for differences in infection efficiency for the oviduct of the corresponding viruses.

In this study, two culture systems for well-differentiated epithelial cells were established, an oviduct organ culture system and a primary cell culture system of isolated COEC. Both systems can be valuable tools in the future to analyse the AvCoV infection of the chicken oviduct in more detail.

keywords

Aviäres Coronavirus, Hühner Ovidukt, Gewebetropismus, avian coronavirus, chicken oviduct, tissue tropism

kb

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