Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Annika Esther Mohr

 

 Multiplex Branched DNA Assay zur Untersuchung der Genexpression von Hormonrezeptoren kaniner Mammatumoren und tumorassoziierter Gene in der Zellkultur

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109314

title (engl.)

Gene expression analyses of hormone receptors in canine mammary tumors and of tumor-associated genes in cell culture by a multiplex branched DNA assay

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/mohra_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Trotz der großen Bedeutung von Mammatumoren beim Hund, liegen bisher kaum Genexpressionsanalysen von Hormonrezeptoren für verschiedene Subtypen vor. Zur Prüfung therapeutischer Ansätze in vitro fehlt zudem eine Differenzierung tumorrelevanter Targetgene in geeigneten kaninen Mammatumorzelllinien.

Um Tumoren der Mamma weitergehend zu charakterisieren, sind molekulargenetische Methoden notwendig. Bevor solche Genanalysen durchgeführt werden, ist eine differenzierte histologische Diagnostik erforderlich. Für die verschiedenen Subtypen beim Hund sind jedoch oft nicht genügend Fälle vorhanden. Um die Fallzahl zu erhöhen, ist die Verwendung von Archivmaterial, wie beispielsweise FFPE-Proben, notwendig. Da deren Lagerung zur Degradierung von DNA und RNA führt, musste zunächst in der vorliegenden Arbeit ein Vergleich zu kryokonservierten Proben durchgeführt werden, um die Anwendbarkeit der molekularbiologischen Technik für FFPE-Proben, einschätzen zu können. Mit dem angewendeten Multiplex Branched DNA Assay können auch sehr kleine RNA-Fragmente in sehr geringen Mengen analysiert werden. Für die Gene der Hormonrezeptoren (ESR1, PGR, PRLR und GHR) aus Mammagewebe des Hundes verschiedener Entitäten wurde daher ein Vergleich von Proben aus kryokonserviertem und FFPE-Material mit dieser Technik durchgeführt. Daraus ergab sich eine hohe Übereinstimmung hinsichtlich des Expressionslevels. Nur bei einer geringen Zahl der FFPE-Proben (15 von 180) lag die Genexpression unter der Nachweisgrenze.

Die Expressionsmuster der Hormonrezeptoren waren abhängig von der Dignität des Tumorgewebes. Es bestanden deutliche Unterschiede zwischen malignem, benignem und nicht-neoplastischem Gewebe, welche sich auch statistisch absichern ließen. In den Untergruppen der malignen Tumoren war außerdem die Expression von ESR1, PGR und PRLR mit der pathohistologischen Prognose assoziiert, was die Hoffnung weckt, dass sie auch als Prognosemarker geeignet sind. Kastrierte Hündinnen zeigten zwar niedrigere Expressionslevel von ESR1 und PGR in malignen Mammatumoren, doch war der Unterschied zu Tumoren unkastrierter Hündinnen nicht statistisch signifikant. Dies kann auf die relativ kleine Probenanzahl in der  Gruppe der kastrierten Hündinnen (kryokonservierte Proben n=16, FFPE-Proben n=13) zurückzuführen sein. Bezüglich der am häufigsten untersuchten Rassen lagen keine Unterschiede in der  Hormonrezeptorexpression vor.

Zellkulturen von Mammatumoren des Hundes, die als Medium für orientierende Studien verschiedener Substanzen in vitro genutzt werden können, gibt es nur wenige. Für die entsprechende Etablierung von Zelllinien wurde geprüft, ob die Expression potenzieller Targetgene aus dem Originalgewebe nach mehreren Passagen in der Zellkultur erhalten bleibt. Dazu wurden verschiedene tumorassoziierte Gene (BRCA1, BRCA2, FOXO3, GATA4, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PTEN und TP53) und die Gene der Hormonrezeptoren ESR1, PGR, PRLR und GHR untersucht. Es wurden 10 Zellkulturen von neoplastischen und von 6 nicht-neoplastischen Mammagewebeproben hergestellt und die Genexpression mit derjenigen im Herkunftsgewebe verglichen. Eine Vielzahl der untersuchten Gene veränderte das Expressionsniveau im Verlauf von 30 Passagen im Vergleich zum Ausgangswert. Eine gleichbleibende und stabile Expression über mehrere Passagen zeigten die Gene HMGA1, HMGB1, MYC und PTEN in Proben neoplastischer und die Gene MAPK3, MYC, PFDN5, PGR und PTEN in Proben nicht-neoplastischer Herkunft. Diese können folglich für weitergehende Therapiestudien geprüft werden.

Der Multiplex Branched DNA Assay war sowohl für die Expressionsanalyse aus unterschiedlich gelagertem Gewebe, als auch aus kultivierten Zellen geeignet. Für die FFPE- Proben liegt der entscheidende Vorteil darin,  RNA geringer Quantität ausreichend sicher zu analysieren. Zudem können mit dem Assay bis zu 100 Gene aus einer Probe gleichzeitig gemessen werden. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit insbesondere für die longitudinale Charakterisierung von 20 Genen in der Zellkultur genutzt.  

abstract (englisch)

Despite the importance of mammary tumors in the female dog, only few studies have been performed analyzing hormone receptor gene expression in histological subtypes. Moreover, for the examination of therapeutic approaches in vitro, a differentiation of tumor-associated target genes in suitable neoplastic mammary cell lines of the dog is missing.

Molecular genetic methods are necessary to further characterize canine mammary tumors. Still, a differentiated histological classification is essential before gen analysis is carried out. As some of the histological subtypes of canine mammary tumors are less frequent than others, it can be challenging to achieve a sufficient number of samples. Therefore, archived material, as for example FFPE specimens, is a valuable source to enlarge the sample size. Because the storage of FFPE samples leads to RNA and DNA degradation, the first step in the present work was to perform a comparison to fresh frozen specimens to evaluate the reliability of the utilized multiplex branched DNA assay for FFPE samples. The referred technique offers the possibility to analyze not only short fragmented RNA, but also low amounts of RNA. Therefore, gene expression of hormone receptors was compared between fresh frozen and FFPE specimens in different entities of canine mammary tissue. The comparison revealed widely comparable expression levels. Only a low amount of FFPE samples (15 of 180) had to be excluded from the analysis due to values below the limit of detection.

The expression pattern of the hormone receptors was associated with the diagnosis of the samples. A marked difference was found between malignant, benign and non-neoplastic tissue which was statistically significant. Regarding the subtypes of mammary carcinomas, gen expressions of ESR1, PGR and PRLR were associated with the histopathological prognosis. This finding raises hope, if the referred genes could be of interest for future prognostic markers in canine mammary tumors. Neutered dogs showed lower expression levels of ESR1 and PGR in malignant mammary tumors, although no statistically significant differences could be found in comparison to tumors of intact dogs. This might be due to the small sample number (fresh frozen samples n=16, FFPE samples n=13). Regarding the most common breeds, no alterations of hormone receptor gene expression could be demonstrated.

There are still few cell cultures of canine mammary tumors, which serve as models for orientating studies evaluating therapeutic substances in vitro. In the present study, gene expressions of potential target genes were analyzed in cell cultures to check if the expression levels in the original tissue are preserved in cultivated cells over several passages. 16 tumor-associated genes (BRCA1, BRCA2, FOXO3, GATA4, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PTEN and TP53) and the hormone receptors ESR1, PGR, PRLR and GHR were analyzed. Ten neoplastic and 6 non-neoplastic mammary cell cultures were established and the gene expression levels were compared to the original tissue. Most of the analyzed genes showed alterations regarding their expression levels in cell culture compared to the starting value. In contrast to that, comparable and stable expressions in both original tissue and cultivated cells was found for HMGA1, HMGB1, MYC and PTEN in neoplastic and for MAPK3, MYC, PFDN5, PGR und PTEN in non-neoplastic cells which could be of usage for further therapeutic studies

The multiplex branched DNA assay revealed to be feasible for the gene expression analysis of different stored tissues, as well as out of cultivated cells. The assay permits to perform analyses with low amounts of RNA which is advantageous for the analysis of FFPE specimens.  In addition, up to 100 genes can be examined within a single sample, a fact which was particularly important in the present study for the longitudinal characterization of 20 genes in cultivated cells.

keywords

Hund, Mammatumor, Hormonrezeptoren, dog, mammary tumor, hormone receptor

kb

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