Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Helene Alwina Möllerherm

Innate immune defense against zoonotic bacterial infections at physiological oxygen conditions

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110794

title (ger.)

Angeborene Immunantwort gegen zoonotische, bakterielle Erreger unter physiologischen Sauerstoffbedingungen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/moellerhermha_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Trotz der intensiven Einsätze von Antibiotika und Impfstoffen gehören Infektionskrankheiten weiterhin zu den weltweit häufigsten Todesursachen und können vor allem in der Tierzucht und Tierhaltung erhebliche wirtschaftliche Schäden verursachen. Viele der auftretenden Infektionskrankheiten sind zoonotischer Natur, das heißt, sie können zwischen Tier und Mensch übertragen werden. Durch das vermehrte Auftreten antibiotikaresistenter Erreger steigt die Wichtigkeit im Kampf gegen Infektionskrankheiten alternative Therapieansätze zu entwickeln, die darauf abzielen, das Immunsystem von infizierten Tieren und Menschen prophylaktisch oder auch therapeutisch zu stärken. Um Zellen des Immunsystems für therapeutische oder prophylaktische Ansätze zu nutzen, müssen die zellulären Prozesse genauer verstanden werden.

Die Etablierung von zuverlässigen primären in-vitro-Zellkultursystemen ist von außerordentlicher Bedeutung, da deren Ergebnisse Aufschluss über in-vivo-Prozesse geben und dadurch die Durchführung von Tierversuchen reduzieren und ersetzen können. Zu diesem Zweck sollten die physiologischen Bedingungen am Ort des Angreifens von Immunzellen bestmöglich nachgeahmt werden. Ein Schlüsselfaktor, der bei der Kultivierung von Primärzellen oft unterschätzt wird, ist der physiologische Sauerstoffgehalt am Aufenthaltsort der Immunzellen in vivo. Traditionell werden primäre Zellen von Mensch oder Tier isoliert und in der Umgebungs-Sauerstoff-Konzentration (21% O2) kultiviert, obwohl die physiologische Sauerstoffkonzentration in den Geweben, die als Physioxie bezeichnet wird (variierend zwischen 1% -12% O2), viel geringer ist. Physiologische Sauerstoffwerte sinken drastisch und werden hypoxisch, wenn Infektionen, Entzündungen oder Autoimmunprozesse lokal auftreten. Interessanterweise wurde bereits gezeigt, dass die zelluläre Homöostase und die Anpassung an Sauerstoffstress post-transkriptional durch den Transkriptionsfaktor Hypoxie induzierter Faktor-1α (HIF-1α) reguliert wird. Dieser Transkriptionsfaktor unterstützt ebenfalls die antimikrobielle Aktivität von Immunzellen, einschließlich der von infiltrierenden Neutrophilen und residierenden Mastzellen.

Das erste Ziel dieser Studie war es, die antimikrobielle Funktion von Neutrophilen und Mastzellen gegen Staphylococcus (S.) aureus unter physiologischem Sauerstofflevel sowie den Einfluss von HIF-1α zu erforschen. In Kapitel 5 wurden Neutrophile unter Hypoxie (1% O2) im Vergleich zu Normoxie (21% O2) inkubiert und mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA), S. aureus Wildtyp oder dem jeweiligen Nuklease-defizienten Mutantenstamm zur Freisetzung von Neutrophilen Extrazellulären Netzen (NETs) stimuliert. Interessanterweise ist die spontane NET-Bildung von Neutrophilen sowie PMA-induzierte NETs unter Hypoxie deutlich reduziert. Durch die Analyse der hif-1α -Genexpression wurde gezeigt, dass die mRNA-Expression von hif-1α sowie hif-1α-Zielgenen nicht beeinflusst ist. Passend zur reduzierten NET-Bildung unter Hypoxie war auch der Cholesteringehalt signifikant erhöht. Bemerkenswerterweise wurde die NET-Bildung aber nicht durch die Stimulation mit S. aureus- Wildtyp oder dem Nuklease-defizienten Stamm beeinflusst.

In Kapitel 6 wurde die antimikrobielle Aktivität von Mastzellen nach Langzeit (24 h) und Kurzzeit (3 h) Hypoxie analysiert, die die chronische Phase und akute Phase einer Infektion nachahmen sollten. Langzeit-Hypoxie führte zu einer Stabilisierung von HIF-1α auf Proteinebene. Gleichzeitig wurde die Bildung von extrazellulären Netzen von Mastzellen (MCETs) erhöht, während die Phagozytose, ein intrazellulärer Tötungsmechanismus, von fluoreszierenden S. aureus-Biopartikeln verringert wird. Im Gegensatz dazu beeinflusste Kurzzeit-Hypoxie die Freisetzung von MCETs und Phagozytose nicht, da HIF-1α nicht stabilisiert wurde. Interessanterweise erhöhte die Kurzzeit-Hypoxie die Sekretion des vorgespeicherten Mediators Histamin und reduzierte die Freisetzung von TNF-α. Um dieses Anpassungsphänomen an Hypoxie zu ergründen, wurde eine Mikroarray-Transkriptom-Analyse durchgeführt: Innerhalb von 13 herunterregulierten Genen wurde der anterograde Transportkomplex, genauer gesagt, das Mitglied der COPII-Vesikel sec24, das für den Transport von Proteinen vom ER zum Golgi-Apparat verantwortlich ist, betroffen. Dies führte zur Hypothese, dass de novo synthetisierte Proteine ​​wie TNF-α im ER unter Hypoxie zurückgehalten werden. Dadurch könnte eine unkontrollierte Degranulation vermieden werden, die zu übermäßiger Entzündung und schwerer Gewebeschädigung führen kann.

Im Gegensatz zu den im Blut zirkulierenden Immunzellen, wie den Neutrophilen, reifen Mastzellen im Gewebe zu adulten Mastzellen heran. Da sich die Funktionalität der Mastzellen bei niedrigen Sauerstoffbedingungen verändert hat, stellt sich die Frage, ob physiologische Sauerstoffwerte in vitro die Reifung dieser Zellen beeinflussen könnten. In Kapitel 7 konnte gezeigt werden, dass auch die Reifung von primären Mastzellen unter physiologischem Sauerstoffgehalt die Geschwindigkeit der Differenzierung sowie ihre Funktionalität ihres reifen Phänotyps in vitro verändert. Murine hämatopoetische Stammzellen wurden unter Physioxie (7% O2; 53 mmHg, 5% CO2) im Vergleich zu Normoxie (21% O2, 159 mmHg, 5% CO2) inkubiert. Es wurde festgestellt, dass die Differenzierungsrate unter Physioxie signifikant verzögert war; darüber hinaus zeigten reife Mastzellen eine Abnahme der Genexpression von hif-1α und ausgewählten Zielgenen vegf, il-6 und tnf-α. Interessanterweise wurde die Expression von foxo3 und vhl erhöht, was auf eine HIF-1α-unabhängige Anpassung an reduzierten Sauerstofflevel hindeutet. Außerdem wurde gezeigt, dass Physioxie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), ein allgemeiner Schlüsselfaktor für die antimikrobielle Aktivität von Immunzellen, und die Menge an intrazellulär gespeichertem Histamin, signifikant verringert.

Diese Studie hebt die Wichtigkeit von physiologischem Sauerstofflevel während der in vitro Differenzierung von primären Immunzellen hervor. Des Weiteren wurde gezeigt, dass hypoxischer Sauerstoffgehalt, der bei Infektionen auftritt, die antimikrobielle Aktivität sowohl von Mastzellen als auch von Neutrophilen erheblich beeinträchtigt.

abstract (englisch)

Despite the intensive use of antibiotics and vaccines, infectious diseases are the most common causes of death worldwide and can cause substantial economic damage, especially in animal breeding and animal husbandry. Many of the occurring infectious diseases are zoonotic, thus they can be transmitted between animals and humans. The emerging incidence of antibiotic-resistant pathogens increases the importance of fighting against infectious diseases by developing alternative approaches which aim to strengthen the immune system and boost the antimicrobial function of immune cells of infected animals and humans prophylactically or even therapeutically. To use these cells for therapeutic or prophylactic approaches, we need to accurately understand physiological cellular processes.

The establishment of reliable primary in vitro cell cultures is of special importance as results are used to clarify in vivo processes and, thus, can help to reduce or replace animal experiments. For this purpose, the physiological conditions at the place of action of immune cells in response to infection should be mimicked as closely as possible. One physiological key factor which is often underestimated when culturing primary cells is the oxygen level in the inflamed or infected tissue in vivo. Traditionally, primary cells are isolated from humans or animals and cultivated in ambient oxygen concentrations (21% O2), although the physiological oxygen concentration in the tissues, termed physioxia (varying 1%-12% O2), is much lower. Physiologic oxygen levels drastically drop to hypoxic levels in case of a local infection, inflammation or autoimmune reaction. Interestingly, it has already been shown that the cellular homeostasis and the adaptation to oxygen stress are post-transcriptionally regulated by the transcription factor hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), which was also shown to support the antimicrobial activity of immune cells including infiltrating neutrophils and tissue resident mast cells.   

The goal of this study was to understand the antimicrobial function of neutrophils and MCs against Staphylococcus (S.) aureus under physiological oxygen levels as well as the contribution of HIF-1α to their cellular functions. As described in chapter 5, neutrophils were temporarily incubated under hypoxia (1% O2) in comparison to normoxia (21% O2), and were stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) or S. aureus wild-type and the respective nuclease-deficient mutant strain to release neutrophil extracellular traps (NETs). Interestingly, the spontaneous NET formation of neutrophils as well as the amount of PMA induced NETs were clearly reduced under hypoxia. By analyzing HIF-1α gene expression, the mRNA level of hif-1α as well as hif-1α target genes were not affected. Convenient to the altered NET formation under hypoxia, the cholesterol content was significantly increased under hypoxia. Remarkably, NET formation was maintained by stimulating with viable S. aureus wild-type or the nuclease-deficient strain.

Chapter 6 presents the analysis of the antimicrobial activity of MCs (MCs) after long- (24 h) or short-term (3 h) exposure to hypoxic conditions mimicking the acute phase of an infection and a chronic phase, respectively. Long-term hypoxia resulted in a stabilization of HIF-1α on the protein level, while extracellular trap formation was increased and intracellular killing mechanisms, like phagocytosis of fluorescent S. aureus bioparticles, was decreased. In contrast, short-term hypoxia did not affect the release of extracellular traps and phagocytosis, when HIF-1α was not stabilized. Interestingly, short-term hypoxia increased the secretion of the pre-stored mediator histamine and reduced the release of TNF-α. To unravel this short-term hypoxic adaptation phenomenon, microarray transcriptome analyses were conducted: within 13 downregulated genes, the anterograde transport complex, more precisely the member of COPII vesicles sec24, responsible for transporting proteins from the ER to the Golgi apparatus, was affected, leading to the hypothesis that de novo synthesized proteins like TNF-α might be retained in the ER under hypoxia, which could result in diminished inflammation and tissue damage due to prevention of uncontrolled degranulation.

In contrast to immune cells circulating through the blood such as neutrophils, MCs mature and remain in distinct tissues. Since their functionality was shown to change under low oxygen conditions, the question arises if physiological oxygen levels might also influence the in vitro maturation of these cells. In chapter 7, it was investigated if the physiological oxygen level determines the rate of differentiation of primary MCs as well as the functionality of MCs’ mature phenotype in vitro. Therefore, murine hematopoietic stem cells were differentiated under physioxia (7% O2; 53 mmHg; 5% CO2) in comparison to normoxia (21% O2, 159 mmHg; 5% CO2). The differentiation rate was observed to be significantly delayed under physioxia; moreover, mature MCs showed a decrease in gene expression of hif-1α and selected target genes vegf, il-6, and tnf-α. Interestingly, the expression of foxo3 and vhl was increased, suggesting a HIF-1α independent adaptation to reduced oxygen levels. Furthermore, the production of reactive oxygen species (ROS), an overall key factor in the antimicrobial activity of immune cells, and the amount of intracellular stored histamine was shown to be significantly decreased in MCs differentiated under low oxygen levels.

This study highlights the importance of considering physiological oxygen levels during differentiation when culturing primary innate immune cells in vitro and hypoxic oxygen levels during infections, respectively, since the antimicrobial activity of both, MCs and neutrophils, is substantially affected by a reduced oxygen level.

keywords

Angeborenes Immunsystem, Staphylococcus aureus, Hypoxie, Innate immunity, Staphylococcus aureus, Hypoxia

kb

1.439