Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Felicitas Miller

Etablierung eines Tiermodells und eines fluoreszenzbasierten in vitro Testsystems zur Untersuchung neuartiger Materialien für die Entwicklung eines Tubenstents

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111421

title (eng.)

Establishment of an animal model and a fluorescence-based in vitro test system to evaluate new materials for the development of an Eustachian tube stent

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/millerf_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Um die Funktion des Mittelohres zu gewährleisten, ist ein Druckausgleich des Mittelohrdruckes zum Umgebungsdruck zwingend erforderlich. Dieser wird allein über die Eustachische Röhre, die Verbindung des Mittelohres zum Rachen, gewährleistet. Kommt es zu einem krankhaften Verschluss derselben, führt dies häufig zu Otitiden, welche bei Fortbestehen zu Mittelohrschwerhörigkeiten und Cholesteatomen führen können.

Da das Krankheitsbild des Tubenverschlusses bis heute nur teilweise erfolgreich behandelt werden kann, ist die Entwicklung neuer Therapiemethoden für Tubenfunktionsstörungen weiterhin dringend notwendig.

Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher Grundlagen geschaffen werden, die eine Überprüfung neuartiger Implantate für die Eustachische Tube (ET) auf ihre Verträglichkeit bzw. Toxizität in vitro als auch in vivo im Tiermodell zu ermöglichen.

Um eine sichere Testung der Toxizität neu entwickelter Implantatmaterialien in vitro analog DIN/ISO 10993 zu gewährleisten, gleichzeitig jedoch auf eine Zugabe von Farbstoffen zu verzichten, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuartiger Zytotoxizitäts-Test etabliert. Dieser beruht auf der Fluoreszenz von stabil eGFP-transfizierten NIH-3T3 Fibroblastenzellen. Durch eine vergleichende Messung der Vitalität der Zellen sowohl im MTT-Test als auch durch Messung des Fluoreszenzsignals wurde dessen Anwendbarkeit bei Eluaten von verschiedenen Materialien (Blei, Kupfer, LD-PE, PDLLA) und bei Verdünnungen mehrerer Chemikalien (Triton x100, DMSO, Silbernitrat) untersucht. Für alle verwendeten Substanzen konnte eine starke Korrelation und somit gute Vergleichbarkeit der beiden Verfahren nachgewiesen werden. Zytotoxische Effekte wurden von beiden Verfahren sicher nachgewiesen.

Abschließend konnte durch dieses Testsystem für erste Polymermaterialien (PDLLA, Mischung aus PDLLA und PLLA), welche für die Anwendung in der ET vorgesehen waren, nachgewiesen werden das diese ungiftig sind.

Um darüber hinaus auch ein Tiermodell zur Testung von für die menschliche Tube entwickelten Implantaten oder Behandlungsmethoden zu haben, wurde zusätzlich die Eignung des Schafes als Modell für die menschliche ET untersucht. An Köpfen von Heidschnucken und Schwarzkopfschafen wurde die ET mit Silikon gefüllt, sowie mittels digitaler Volumentomografie (DVT) Länge, Durchmesser und Krümmung der Tube bestimmt. Dabei unterschieden sich beide Schafrassen allein in Gesamtlänge, als auch der Länge zwischen Isthmus und Ostium pharyngeum tubae auditivae. Vergleicht man diese Daten mit Literaturangaben der ET des Menschen, so stellt man fest, dass gerade die Bereiche zwischen Isthmus und Rachen bei Schwarzkopfschaf und Mensch sehr gut übereinstimmen. Da im Rahmen des Projektes die Implantation eines Stents über den Rachen geplant ist, ist gerade dieser Bereich für die Übertragbarkeit entscheidend. Damit kann insbesondere das Schwarzkopfschaf als mögliches Modell für die menschliche ET angesehen werden.

Um die Anwendbarkeit des Tiermodelles hinsichtlich der Testung neu entwickelter Implantate zu untersuchen, wurde sowohl die endoskopische Darstellbarkeit der ET über die Nase, als auch die Möglichkeit der Implantation eines ersten Stents im Schafmodell evaluiert. Dabei war ein endoskopischer Zugang zur ET über den ventralen Nasenkanal, als auch die Implantation des Stents über den Arbeitskanal des Endoskops erfolgreich. Folglich konnte eine generelle Eignung des Schafes als Tiermodell für die ET des Menschen gezeigt werden.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit Grundlagen geschaffen werden, die eine Prüfung neuartiger Implantaten für die ET ermöglichen.

abstract (englisch)

Equalization of middle ear pressure is mandatory to compensate for differences in the ambient air pressure. This is provided by the Eustachian tube (ET) the only connection between middle ear and throat. Loss of ET-function can lead to otitis media, middle ear deafness and cholesteatoma. As tubal occlusions can nowadays only be treated partially, the development of new treatment strategies is urgently needed. One of these strategies might be an ET-stent.

The scope of this study is the development of in vitro and in vivo test systems, to investigate the compatibility and toxicity of materials for new treatments of ET disorders.

A reliable detection of toxic effects of new implant materials has to be ensured. To meet this requirement an in vitro cytotoxicity test without the need of a dye was developed. This test is based on the fluorescence of a fibroblast cell line genetically modified for the expression of eGFP (NIH-3T3-eGFP). The test was validated against the results of the MTT-test, which is suggested by DIN/ISO 10993. To measure cell viability by fluorescence, measurements were integrated into the standard procedure of the MTT test. Reliability and applicability of the fluorescence measurement was shown for eluates of different solid materials (lead, copper, LD-PE, PDLLA) as well as liquid chemicals such as Triton x-100, DMSO, or silver nitrate. A high correlation between both methods was found for all substances. Toxic effects could be detected with both approaches in all cases. Finally, polymeric sample materials intended for application in the Eustachian tube were shown to be non-toxic by use of the fluorescence-based cytotoxicity test.

In addition an appropriate in vivo model for the human ET is needed for preclinical testing of new ET treatments. As the sheep was known to be a reliable model for the human middle ear, it was investigated for dimensions and accessibility of its ET.

The ET of heathland sheep and blackface sheep were filled with silicone and contrast agent, and were scanned using digital volume tomography (DVT). The lengths, diameters and angles of the ET were measured in the scan data and on the received silicone models of the ET. Diameters and lateral parts of the ET of both breeds were comparable whereas the length of the entire ET as well as the distance from isthmus to pharynx was larger in blackface sheep. Especially the distance between isthmus and pharynx in blackface sheep corresponds very well to published human data. This region is of particular interest as an implantation of a stent via the pharynx is intended. Hence, it could be documented, that the sheep, in particular the blackface sheep, is a possible model for the human Eustachian tube.

To test this animal model for newly developed implants for the ET, an endoscopic approach to the ET through the nose was evaluated and a first implantation of a stent was performed in cadaver experiments. Endoscopic accessibility of the ET through the lower nasal meatus, as well as implantation of a stent through the working channel of the endoscope were shown and stents could be positioned within the ET. Thus the general suitability of the sheep as an animal model for the human ET could be verified. Therefore, the basis for a successful development and test of new implants for the Eustachian tube was established within this dissertation.

keywords

Eustachische Tube, Tiermodel, Zytotoxizität ; Eustachian tube, Animal model, Cytotoxicity

kb

2.126