Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Marie Meyerholz

Einfluss der Frühträchtigkeit auf die metabolische Adaptation bei Färsen mit besonderer Bedeutung des Wachstumshormons und insulinähnlichen Wachstumsfaktors

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105102

title (engl.)

Influence of early pregnancy on metabolic adaption of Holstein Friesian heifers with particular importance of Growth Hormone and Insulin-like Growth 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/meyerholzm_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Die somatotrope und die thyreotrope Achse sind als wichtige Regulatoren der embryonalen sowie fetalen Wachstums- und Differenzierungsprozesse bekannt. Es ist allerdings nicht eindeutig geklärt, welchen Einfluss die frühe Trächtigkeit auf das maternale GH-/IGF-System und den Schilddrüsenhormon-Haushalt ausübt und inwiefern Sexualsteroidhormone oder Mechanismen der embryo-maternalen Kommunikation für etwaige Veränderungen verantwortlich sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Frühträchtigkeit auf endokrine Parameter der somatotropen sowie thyreotropen Achse zu untersuchen und dafür die Konzentrationen der Komponenten beider Achsen bei tragenden und nicht-tragenden Färsen an Tag 0 (Tag der Ovulation, detektiert mittels Ultraschall), sowie Tag 7, 14, 16, 18 zu vergleichen. Außerdem sollte getestet werden, ob das embryonale Signal Interferon tau (IFNτ) bereits an Tag 18 der Trächtigkeit die maternale Leber erreicht. Dafür wurden Blutproben an besagten Zeitpunkten sowie Leberbiopsien an Tag 18 von Holstein Friesian Färsen (n=30) in mehreren aufeinanderfolgenden tragenden (p) und nicht-tragenden (np) Reproduktionsabschnitten entnommen. Die Tiere wurden entweder künstlich besamt (Artificial Insemination; AI) oder erhielten einen Embryotransfer (ET). An Tag 18 wurde die Konzentration von Progesteron (P4) im Blut der Tiere bestimmt, um zu beurteilen, ob die Möglichkeit einer Trächtigkeit besteht. An Tag 18 der Reproduktionsabschnitte mit ET wurde bei allen Tieren eine Uterusspülung durchgeführt und nach Beurteilung des zurückgewonnenen Inhaltes erfolgte die Gruppenzuordnung. Färsen, die eine P4‑Konzentration von >2,0 ng/ml sowie eindeutig identifizierbares Trophoblastengewebe in der Uterusspülung aufwiesen, wurden als tragend klassifiziert (n=12). Am Ende eines Reproduktionsabschnittes mit AI erfolgte keine Uterusspülung, stattdessen wurde das Vorliegen einer Trächtigkeit an Tag 18 retrospektiv beurteilt. Tiere, deren P4-Werte nach AI an Tag 18 >2 ng/ml waren und bei denen an Tag 42 ultrasonographisch ein Embryo mit Herzschlag nachgewiesen werden konnte, wurden als tragend klassifiziert (n=21). Im Gegensatz dazu wurden Tiere, deren P-Werte an Tag 18 im Blut <1,0 ng/ml waren und bei denen keine Trophoblastenanteile in der Spülflüssigkeit in Reproduktionsabschnitten nach ET nachgewiesen werden konnten, bzw. in Abschnitten mit AI an Tag 18 bereits Brunstsymptome zeigten, der Gruppe der nicht-tragenden Tiere zugeordnet (n=39). Reproduktionsabschnitte mussten von der Auswertung ausgeschlossen werden (n=7), wenn die Tiere Ovarialzysten hatten (n=2), wenn innerhalb eines Abschnittes zwei Gelbkörper auftraten (n=1) oder wenn an Tag 18 keine eindeutige Gruppenzuordnung möglich war (n=4). Aus den verbleibenden 72 Reproduktionsabschnitten wurden 38 ausgewählt, bei denen es möglich war innerhalb eines Tieres einen eindeutig tragenden mit einem eindeutig nicht‑tragenden Reproduktionsabschnitt zu kombinieren (n=19; np-p oder p-np). In dieser gepaarten Form wurden die Reproduktionsabschnitte statistisch als wiederholte Messungen ausgewertet, um individuelle Veränderungen der Tiere über den Zeitverlauf berücksichtigen zu können. Folgende Parameter wurden mittels validierter Immunoassays in allen Blutproben bestimmt: P4, Gesamtöstrogene, Wachstumshormon (GH), Insulin, Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II (IGF-I, IGF-II). Thyroxin (T4) und Triiodthyronin (T3) wurden in den Blutproben von Tag 0, 14 und 18 untersucht. Darüber hinaus wurden zu diesen drei Zeitpunkten auch die Serumkonzentrationen der IGF-Bindungsproteine 2, -3 und -4 mittels Western Ligand Blot untersucht. Die hepatische mRNA Expression von Wachstumshormon‑Rezeptor-1A (GHR1A), IGF-I, IGF-II, IGFBP 2 bis -4 sowie Interferon‑Stimuliertes Protein 15 kDa (ISG-15), Myxovirus Resistenz Proein-1 (MX-1) und Deiodinase-1 (DIO-1) wurde mit Hilfe von qPCR gemessen. Die Genexpression von MX-1 und ISG-15 war signifikant höher in den Leberbiopsien der tragenden Färsen an Tag 18 im Vergleich zu den nicht-tragenden Tieren. Dieses Ergebnis impliziert, dass bei der Färse das embryonale Signal IFNτ bereits an Tag 18 der Trächtigkeit die maternale Leber erreicht. Des Weiteren verhielten sich P4 und Gesamtöstrogene an Tag 18 in den Gruppen p und np gegensätzlich. Aufgrund dieser Befunde wurde vermutet, dass alle in dieser Studie beobachteten systemischen Veränderungen an Tag 18 auf die Trächtigkeit zurückzuführen sind und entweder durch IFNτ oder Steroidhormone verursacht werden. Nach einem signifikanten Abfall bis Tag 16 stiegen die IGF-I-Konzentrationen in beiden Gruppen zwischen Tag 16 und 18 signifikant an, obwohl die Steroidhormone sich gegensätzlich verhielten und GH lediglich bei den nicht-tragenden Färsen zwischen diesen beiden Zeitpunkten signifikant anstiegt. Im Vergleich zu IGF-I zeigte IGF-II einen reziproken Verlauf und war an Tag 16 in tragenden Färsen höher als in nicht-tragenden. Außerdem sank IGFBP2 nur in der Gruppe p zwischen Tag 0 und 14 signifikant ab. Dieser Abfall könnte als systemischer Regulationsmechanismus für die Bioverfügbarkeit von IGF-II fungieren. In der Phase der embryo-maternalen Kommunikation (Tag 14-16) war die Serumkonzentration von Insulin bei tragenden Färsen niedriger als bei nicht-tragenden, was Ausdruck einer verstärkten Insulinsensitivität während der frühen Trächtigkeit sein könnte. Die Konzentration von maternalem IGFBP4 in tragenden Tieren war niedriger verglichen mit nicht-tragenden Tieren an Tag 18, was auf verstärkter Proteolyse-Aktivität zurückzuführen sein könnte. IGFBP4 kann die Wirkung von IGF-I inhibieren und somit durch erhöhte Konzentrationen von freiem IGF-I die lokale Bioverfügbarkeit erhöhen, die möglicherweise für die Vorbereitung der adäquaten Umgebung für die Einnistung eines potentiellen Embryos und somit für die uterine Rezeptivität notwendig ist. In Bezug auf die Schilddrüsenparameter wurden zwar keine Unterschiede zwischen der Leberexpression der DIO-1 an Tag 18 zwischen den Gruppen p und np gefunden und auch die Serumkonzentration von T4 zeigte weder Gruppen- noch Trächtigkeitseffekte. Die peripheren Konzentrationen von T3 waren jedoch bei tragenden Tieren niedriger als bei nicht-tragenden und sanken bei trächtigen Färsen zwischen Tag 0 und 18 signifikant ab. Diese Veränderungen könnten auf den Einfluss von Progesteron zurückzuführen sein, könnten aber auch durch verstärkte Deiodinase-Aktivität in anderen Geweben als der Leber zu Stande gekommen sein. Diese verminderten T3-Konzentrationen während der frühen embryonalen Entwicklung könnten einerseits einen erhöhten Bedarf an T3 in den Reproduktionsorganen und somit erhöhte lokale Aktivität der Schilddrüsenhormone bzw. verstärkten Iod-Bedarf des Embryos widerspiegeln, andererseits könnten diese Veränderungen auf verminderte systemische metabolische Aktivität hindeuten, da der maternale Organismus die Trächtigkeitserkennung und -erhaltung in dieser Phase in den Fokus stellt. Zusammenfassend zeigen die Daten der vorliegenden Studie vielseitige Veränderungen der Komponenten sowohl der somatotropen als auch der thyreotropen Achse auf systemischer Ebene während der frühen Trächtigkeit bzw. während des physiologischen Zyklus. Um die zu Grunde liegenden Mechanismen der beobachteten Veränderungen im Detail zu verstehen, sind weitere Analysen nötig, die mittels In-vivo- und/oder In-vitro-Modellen lokale und systemische Veränderungen des Stoffwechsels in früh-trächtigen Kühen verknüpfen und dabei herausarbeiten, welche Effekte durch Steroidhormone und welche durch die Trächtigkeit hervorgerufen werden. Das genauere Verständnis dieser Mechanismen könnte insbesondere bei der Milchkuh von Bedeutung sein, da eine herabgesetzte Insulinsensitivität sowie hypothyreote Stoffwechselsituationen während der Laktation auftreten und eventuell mit herabgesetzter Fertilität in Verbindung stehen.

abstract (englisch)

In different species the somatotropic and the thyreotropic axis are known to play important roles for embryonic growth as well as for tissue development and differentiation. However, less is known about the effect of early pregnancy on the maternal GH-/IGF-system and thyroid hormone metabolism by mechanisms like embryonic signaling and/or changes of sexual steroid hormone patterns. The aim of the present study was to investigate endocrine endpoints of the somatotropic and thyreotropic axes in pregnant vs non-pregnant dairy heifers until d 18 of pregnancy. Furthermore, it was tested, whether the embryonic signal Interferon tau (IFNτ) already enters the maternal liver by d 18 of pregnancy. Blood samples of Holstein Friesian heifers (n=30) were taken on d 0 (day of ovulation, defined by ultrasonography) and days 7, 14, 16 and 18 in repeated consecutive pregnant (p) and non‑pregnant (np) periods. Additionally, liver biopsies were taken on d 18. Heifers received artificial insemination or embryo transfer and pregnancy was verified either on d 18 (Progesterone (P4) >2.0 and successful recovery of a conceptus [n=12]) or retrospectively on d 42 (detection of embryonic heart beat [n=21]). The cows were defined as np on d 18 if P4 was <1.0 and no conceptus was recovered (n=39). Several periods had to be excluded (n=7) due to cysts (n=2), double CL (n=1) or unclear pregnancy status on d 18 (n=4). Out of the remaining 72 periods, 38 were selected in which it was possible to build pairs within each heifer (n=19; np-p or p-np) for analysis by ANOVA as repeated measurements. By the use of validated immunoassays, concentrations of P4, estrogens, Growth Hormone (GH), insulin, Insulin-like Growth Factor‑I and ‑II (IGF-I, IGF-II) were measured in blood samples of all days, while Thyroxine (T4) and Triiodothyronine (T3) were investigated in samples of d 0, 14 and 18. The serum concentrations of IGF-Binding Proteins 2, -3, -4 were determined at d 0, 14 and 18 as well using a quantitative western ligand blot. Hepatic mRNA expression of Growth-Hormone-Receptor-1-A (GHR1A), IGF-I, IGF-II, IGFBP2 to -4 as well as Interferon-stimulated protein 15 (ISG-15), myxovirus-resistance protein-1 (MX-1) and Deiodinase-1 (DIO-1) was measured by qPCR. The hepatic mRNA expressions of MX-1 and ISG-15 were significantly higher in liver biopsies of pregnant heifers on d 18 compared to non-pregnant heifers. These data implicate that embryonic signaling via IFNτ reaches the maternal liver already on d 18 of pregnancy in dairy heifers. This fact leads to the assumption that all systemic changes observed in this study on d 18 may be due to pregnancy by either IFNτ or a steroid hormone impact as these hormones differed significantly in p compared to np heifers on d 18. Between d 16 and 18 IGF-I increased in p and np heifers, although P4 and estrogens were different whereas GH only increased significantly in np animals between these two time points. Regarding the data of IGF-I, it is obvious that the detected changes cannot originate from P4 only. IGF-II showed a reciprocal run compared to IGF-I and was higher on d 16 in group p compared to np. Furthermore, IGFBP2 levels were lower in p compared to np, which could serve as regulating mechanism for IGF-II bioavailability even on systemic level. Insulin serum concentrations were lower in group p than in np during the phase of early embryo-maternal communication (d 14-18), which indicates enhanced systemic sensitivity towards insulin in cattle during early pregnancy. The IGFBP4 concentration was significantly lower in pregnant heifers on d 18 and this reduced maternal IGFBP4 might be due to enhanced proteolytic activity. As IGFBP4 can inhibit IGF-I action these data propose that it might also lead to increased free IGF-I levels and this enhanced bioavailability of IGF-I could be necessary for local preparation of the potential embryonic microenvironment and endometrial receptivity of pregnant individuals. Concerning thyroid hormone action: liver DIO-1 expression did not differ between p and np on d 18 and T4 serum concentration showed neither group nor time-effects. But peripheral T3 concentrations tended to be lower in p compared to np and significantly decreased between d 0 and 18 in pregnant heifers. These time changes could be due to a P4 influence and might be caused by an enhanced deiodinase activity in tissues other than the liver. On the one hand decreased T3 blood levels during early embryonic development could reflect an increased demand within reproductive tissues and enhanced local thyroid hormone activity or iodine requisition of the embryo, on the other hand the changes could be due to down-regulated systemic metabolic processes as the maternal organism is focusing on pregnancy recognition and maintenance. In conclusion the presented data show multifarious changes of components of the somatotropic as well as the thyreotropic axis on systemic level in the maternal circulation in early pregnancy or during the physiological cycle. Understanding the underlying mechanisms of the observed changes requires further investigation with in vivo and/or in vitro models focusing on the connection of local and systemic metabolic adaption in early pregnant cows and at the meantime differentiating between pregnancy and steroid hormone effects. Understanding these processes could be relevant especially in cattle, since decreased insulin sensitivity as well as hypothyroid episodes occur during lactation and may be related to reduced fertility of the dairy cow.

keywords

Wachstumshormon, Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I, Schilddrüse, Growth Hormone, Insulin-like Growth Factor-I, thyroid gland

kb

16.592