Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Cora Meyer

Peripheral nerve regeneration using hollow and enriched chitosan-based guidance conduits

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105760

title (ger.)

Periphere Nervenregeneration unter Verwendung von leeren und angereicherten Chitosan-basierten Nervenleitschienen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/meyerc_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Periphere Nervenverletzungen stellen ein globales Problem dar, von welchem insbesondere junge Männer in ihren arbeitsfähigen Jahren betroffen sind. Im Zuge von Quetschungen ist eine Wiederherstellung der Funktionalität wahrscheinlich, während die Heilungschancen nach kompletten Nervendurchtrennungen variieren und ein chirurgischer Eingriff erforderlich ist. Falls ein spannungsfreies Verbinden der beiden Nervenstümpfe nicht möglich ist, ist der Einsatz von Nervenleitschienen unerlässlich. In der Klinik wird in diesen Fällen in der Regel ein autologes Nerventransplantat verwendet, welches von einem funktionell entbehrlichen sensiblen Nerven gewonnen wird. Diese Methode hat jedoch Nachteile, da eine zweite Operation nötig ist, das potenziell zu entnehmende Nervengewebe begrenzt ist und es zu Inkompatibilitäten zwischen dem Spender- und Empfängernerv kommen kann. Des Weiteren wird lediglich in der Hälfte der Fälle, welche mit einem Autotransplantat behandelt werden, eine erfolgreiche Regeneration beobachtet. Folglich werden alternative Überbrückungsstrategien für Nervenlücken benötigt. Hierfür wurden bereits verschiedene Synthetik- als auch Biomaterial-basierte Nervenleitschienen getestet und zum Teil auch von der „Food and Drug Administration“ (FDA) sowie „Conformité Européenne“, zu Deutsch „Europäische Gemeinschaft“, zur Behandlung am Menschen zugelassen. Allerdings hat bisher keine dieser Nervenleitschienen eine breite Akzeptanz in der klinischen Anwendung gefunden.

Folglich war es ein Ziel dieser Arbeit leere Chitosan-basierte Nervenleitschienen verschiedener Acetylierungsgrade (DAI-III) für die Überbrückung von kleinen Nervendefekten, wie sie z.B. bei Handnerven häufig vorkommen, zu testen. Zu diesem Zwecke wurden Kurzzeit- und Langzeitstudien durchgeführt über Zeiträume von 5 und 18 Tagen, sowie 13 Wochen (Projekt 1). Des Weiteren wurden Chitosan Röhrchen mit einem Hyaluronsäure- und Laminin-basiertem Gel (NVR-Gel) befüllt, in welchem genetisch veränderte neonatale Schwann Zellen suspendiert waren (Projekt 2). Letztere wurden dahingehend modifiziert, dass sie entweder eine erhöhte Expression von GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor) oder der 18kDa FGF (fibroblast growth factor)-2-Isoform aufwiesen. Neben dem reversen autologen Nerveninterponats wurden physiologische sowie mit einem Leervektor-transfizierte Schwann Zellen (in Gel) als Kontrollen transplantiert. Mit der Ergänzung von intraluminalen Leitstrukturen und Schwann Zellen sollte die Behandlung von größeren Nervendefekten, wie sie z.B. für den Plexus brachialis beschrieben sind, angesprochen werden, da diese die Regeneration potenziell unterstützen können. Für beide Projekte wurde das Modell des Nervus ischiadicus bei der Ratte (10 mm oder 15 mm Lücke) gewählt, welches als Standard-Modell zur Untersuchung peripherer Nervenregeneration gilt. Es bietet die Möglichkeit, die motorische als auch sensorische Regeneration u.a. durch elektrophysiologische Messungen, die Feststellung des SSIs (Static Sciatic Index) als auch durch den von Frey Test zu beurteilen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ferner die Gewebereaktion auf das Implantieren der Chitosan-basierten Nervenleitschienen untersucht, um eine starke Abwehrreaktion auszuschließen.

Die Ergebnisse, die im Projekt 1 erzeugt wurden waren vielversprechend und eine erfolgreiche, mit dem Autotransplantat vergleichbare, Nervenregeneration konnte für Chitosan Röhrchen aller Azetylierungsgrade, bei einer Überbrückungsdistanz von 10 mm, festgestellt werden. Bei nahezu allen Tieren konnte die Reinnervation distaler Muskeln nachgewiesen werden und die Immunantwort zeigte eine deutliche Reduktion im Zeitverlauf. Letzteres äußerte sich in einer Abnahme aktivierter Makrophagen und multinukleärer Riesenzellen in der fibrösen Kapsel, welche sich um die Chitosan Röhrchen gebildet hatte. Zusätzlich konnte eine Verringerung der Makrophagen im Regenerat beobachtet werde, während die Anzahl der multinukleären Riesenzellen hier im Zeitraum von 18 Tagen bis 13 Wochen unverändert gering blieb. Es ist ferner von Bedeutung, dass die Regulation von beispielhaft ausgewählten Regenerations-assoziierten Proteinen in Spinalganglien und dem Rückenmark durch die Implantation der Nervenleitschienen nach 5 und 18 Tagen nicht beeinflusst wurde. Eine morphometrische Analyse der distalen Nervenabschnitte zeigte jedoch ein erhöhtes Maß an axonalen Verzweigungen für die DAI Gruppe, während die DAIII Röhrchen bereits nach 18 Tagen und verstärkt nach 13 Wochen Risse und Bruchstellen aufwiesen und zum Teil gänzlich auseinandergebrochen waren. Folglich wurden DAII Nervenleitschienen für weitere Experimente ausgewählt, da sie die periphere Nervenregeneration am besten unterstützen.

Für Projekt 2 wurden die angereicherten Nervenleitschienen für die Überbrückung einer Distanz von 15 mm getestet. Bis zum Ende der Studie wurden mit dem autologen Nerventransplantat konsequent die besten Ergebnisse erzielt. Lediglich die Gruppe, welche FGF-218kDa überexprimierende Schwann Zellen transplantiert bekommen hatte, zeigte Regeneration in 4 von 7 Tieren. In diesen konnte auch eine partielle Wiederherstellung der Funktionalität gezeigt werden, während dies nur für ein Tier der GDNF sowie physiologischen Schwann Zell Gruppe zutraf. Diese Ergebnisse implizieren, dass die Nutzung von Gel zur Befüllung von Nervenleitschienen nicht die ideale Wahl ist. Möglicherweise fungiert es als physische Barriere und verhindert somit einen erfolgreichen Regenerationsprozess. FGF-218kDa scheint jedoch einen kompensatorischen Effekt zu haben und das axonale Wachstum, auch durch das Gel hindurch, zu ermöglichen.

Aus den Resultaten beider Projekte lässt sich folgern, dass DAII Chitosan-basierte Röhrchen eine Alternative für die bereits erhältlichen Nervenleitschienen darstellen um kleine Nervendefekte zu überbrücken. Neben den vielversprechenden Ergebnissen im Rahmen von Projekt 1 besticht dieses Röhrchen durch seine Transparenz. Diese Eigenschaft macht es für den klinischen Einsatz besonders attraktiv, da so die Handhabung für den Chirurgen erleichtert wird und eine schnelle und korrekte Positionierung des Implantates möglich ist. Bezüglich der Behandlung von großen Nervendefekten geht die Suche nach einer idealen, intraluminalen Leitstruktur / Füllung weiter und zusätzliche Experimente sind unerlässlich. Alternativen, welche die Axone leiten ohne den Raum im Röhrchen komplett zu füllen, wie z.B. sehr poröse Schwämme, Membranen oder Fasern, sind demnach vermutlich besser für diese Aufgabenstellung geeignet als Gele.

abstract (englisch)

Peripheral nerve injuries (PNIs) represent a global problem, which mainly affects young men in their work productive years. Following crush injuries, patients will likely experience a full functional recovery. If the nerve is completely transected, on the other hand, surgical intervention is needed and the outcome is highly variable. Cases, which do not allow tensionless end-to-end repair, require a bridging strategy to overcome the gap. As a clinical standard therapy, surgeons in such situations usually harvest a negligible sensory nerve and use it to reconnect the two nerve stumps. This method, though, has disadvantages including the need of a second surgery, limited amount of available tissue as well as mismatch issues between the donor nerve and the affected nerve. In addition, only about 50 % of the patients treated with autologous nerve grafts (ANGs) are reported to have a successful recovery. Due to these reasons, alternative strategies are needed to bridge nerve defects. Various synthetic as well as biologically-derived materials have already been tested and some have been approved by the "Food and Drug Administration" and "Conformité Européenne" to be marketed as nerve guidance conduits for small gaps, but none of these conduits is completely accepted in the clinics.

Aim of the present study was to test hollow chitosan-based nerve guidance conduits of 3 different degrees of acetylation (DAI-III) for their possible application in treatment of small gaps (e.g. in digital nerves) (project 1). Therefore, short (5 days and 18 days) and long-term (13 weeks) studies were conducted. In addition, bridging of long gaps (e.g. in brachial plexus injuries) was addressed by introducing luminal fillers into the hollow chitosan conduits, which should, amongst others, support axonal elongation (project 2). Genetically modified neonatal Schwann cells (SCs) over-expressing either glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) or the low molecular weight isoform of fibroblast growth factor-2 (FGF-218kDa) were suspended in a hyaluronic acid and laminin containing gel (NVR-Gel), which was then injected into the chitosan scaffold. Empty vector-transfected SCs as well as non-transfected SCs served as controls besides the reversed ANG in this study of 17 weeks duration. For both objectives, the nerve guidance conduits were tested in the rat sciatic nerve model (10 mm or 15 mm gap), which is frequently used to evaluate peripheral nerve reconstruction. This animal model offers the opportunity to assess motor and sensory recovery by means of electrophysiological recordings, Static Sciatic Index, and the von Frey test. Furthermore, the tissue response in presence of the chitosan implants was analyzed to exclude the possibility of a strong inflammatory response.

Project 1 led to very encouraging results. Hollow chitosan conduits of all DAs allowed peripheral nerve regeneration in a similar manner as ANGs across a 10 mm nerve defect. Motor recovery was observed in almost all animals and the analysis of the inflammatory response revealed a clear reduction in the number of activated macrophages and multinucleated giant cells (MGCs) in the fibrous capsule, which had developed around the conduits over time. In addition, less macrophages were found after 13 weeks than 18 days in the regenerated nerve tissue, while the number of MGCs remained comparably equal and low. Noteworthy, no changes in the regulation of selected regeneration-associated proteins was detected as a response towards the conduits in dorsal root ganglia or the spinal cord 5 and 18 days after conduit implantation. Morphometric data, however, revealed increased sprouting of axons in the presence of DAI conduits, while DAIII conduits demonstrated a fast degradation rate. Upon explantation, the latter were partly broken and displayed fissures and cracks. As a consequence of these observations, DAII conduits were chosen for further experiments, since these conduits were most promising to support peripheral nerve regeneration.

For project 2, DAII conduits were enriched and tested in a critical 15 mm defect. At the end of the study, the group that had received ANGs was superior compared to the experimental groups that had received chitosan conduits containing enriched gel. Solely, the FGF-218kDa group showed nerve tissue regeneration in 4 out of 7 animals, which also displayed motor recovery; while it was only one animal from the GDNF and non-transfected SCs group, respectively. These results indicate that the introduction of gel as a luminal filler might not be the best choice, since it possibly acts as a physical impediment to peripheral nerve regeneration and only FGF-218kDa seems to partially compensate for this negative effect.

Reflecting the findings of both studies it can be concluded that DAII chitosan-based conduits represent an alternative to the marketed conduits for treatment of small gaps. Besides the promising results obtained in this study, it is especially appealing for clinical use because of its transparency. The latter property facilitates the handling procedure for the surgeon and reduces the time needed for correct positioning of the implant. Regarding treatment of long gaps, however, the search for an optimal luminal filler / guidance structure continuous and further experiments are indispensable. Alternatives, which guide the regrowing axons without filling the whole luminal space, such as highly porous sponges, membranes, and fibers, are probably better suited for this task than gel.

keywords

Peripheral nerve injuries, Chitosan, Schwann cells and neurotrophic factors

kb

9.243