Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Thorsten Meißner

Characterization of the metabolic adaption of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis to the host environment by studying isogenic mutants

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105061

title (ger.)

Charakterisierung der metabolischen Anpassung im Wirt von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis anhand genetischer Deletionsmutanten 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/meissnert_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Johne'schen Krankheit, einer chronisch granulomatösen Enteritis bei Wiederkäuern. Jedoch, sind auch Infektionen beim Menschen beschrieben worden. Ein Zusammenhang mit Morbus Crohn und Diabetes Typ I wird zudem derzeit diskutiert.

Das Bakterium besitzt MAP-spezifische lange Sequenzpolymorphismen (LSPs), deren Relevanz für die Pathogenität von MAP noch nicht vollständig erforscht ist. Auf dem LSP14 befindet sich das mptD Gen, welches zu einem vermeintlichen Transporter gehört (mpt Operon), der auf einer putativen Pathogenitätsinsel liegt. Dieses Operon besitzt Gene für einen „ATP binding cassette“ (ABC) Transporter (mptA-C) und einen „energy coupling factor“ (ECF) Transporter (mptD-F). Die Gene mptA-C codieren Proteine für einen Carboxymycobactintransporter, der mit der oxidativen Antwort in der frühen Phase der Makrophageninfektion assoziiert ist. Die genaue Funktion der mptD-F Gene ist bisher noch unklar.

Die vorliegende Arbeit zeigt die Charakterisierung einer mptD Deletionsmutante. Um die Rolle von MptD zu charakterisieren, wurden in vitro Wachstumsstudien in einem Komplex- und einem Minimalmedium durchgeführt. Die MAPΔmptD Mutante wies hierbei ein verzögertes Wachstum im Minimalmedium auf. Zudem zeigte MAPΔmptD in den Infektionsversuchen mit murinen Makrophagen, eine signifikante Abnahme koloniebildender Einheiten nach 2 Stunden. Dieser Phänotyp weist darauf hin, dass MAPΔmptD in der frühen Phase der Anpassung an das Makrophagenmilieu gehindert ist. Der Infektionsversuch in der Maus bestätigte diesen MptD-Phänotyp. Die Ursache für die Attenuation von MAPΔmptD in vitro und in vivo scheint in metabolomischen Veränderungen begründet zu sein, die durch die Transkriptions- und Metabolomanalysen aufgedeckt wurden. Zusammengefasst weisen die Daten daraufhin, dass MptD ein wichtiger Faktor für die metabolomische Anpassung in der frühen Phase der Makrophageninfektion ist.

In der Promotorregion des mptAs liegen zudem zwei putative fur-Boxen, die zu der Annahme führten, dass der metallabhängige Regulator FurA das mpt Operon reguliert. Über weitere Funktionen des FurA ist kaum etwas bekannt. In MTB wurde gezeigt, dass FurA seine eigene Expression und die der Katalase-Peroxidase KatG reguliert. Da KatG durch oxidativen Stress induziert werden kann und als wichtiger Virulenzfaktor in MTB beschrieben ist, wurde für FurA ebenfalls eine wichtige Rolle in der oxidativen Stressantwort vermutet. Als archaischer Regulator weist FurA eine ähnliche genetische Organisation in der Ordnung Actinomycetales auf und könnte somit auch in MAP an der oxidative Stressantwort beteiligt sein. Bisher wurde FurA in MAP jedoch noch nicht näher charakterisiert. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass FurA wichtig für das intrazelluläre Überleben von MAP im Makrophagen ist.

Im zweiten Teil dieser Arbeit, wurde eine furA Deletensmutante hergestellt und mittels in vitro und in vivo Studien charakterisiert. Es zeigte sich in der Transkriptions­analyse, dass verschiedenste Gene für den Lipidstoffwechsel und vor allem entscheidende Gene der oxidativen Stressantwort in der Expression beeinflusst waren. Die Auswirkungen dieser Veränderung führten im Tierversuch zu einer verminderten biologischen Fitness der MAPΔfurA Mutante. Insgesamt zeigen die Daten somit, dass FurA wichtig für die Virulenz von MAP ist.

Mittels beider Studien konnte gezeigt werden, dass MAP-spezifische Elemente (MptD) sowie archaische Elemente (FurA) wichtig für die Pathogenität von MAP sind. Sowohl MptD als auch FurA scheinen vor allem in der frühen Phase der Infektion eine wichtige Rolle zu spielen.  

abstract (englisch)

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) causes Johne's disease, a chronic granulomatous enteritis in ruminants. Furthermore, infections of humans with MAP have been reported and a possible association with Crohn's disease and diabetes type I is currently discussed. MAP owns unique large sequence polymorphisms (LSPs). The relevance of these LSPs in the pathobiology of MAP is, however, yet unclear. The mptD gene of MAP belongs to a predicted transporter operon (mpt operon) located on a pathogenic island of the MAP-specific LSP14. The mpt operon encodes for two transporters, an ATP binding cassette transporter (ABC, mptA-C) and an ECF transporter (mptD-F). The mptA-C encodes for a carboxymycobactin transporter linked to oxidative stress in the early infection, the role of mptD-F is unknown yet. In the presented study, a generated mptD knockout strain (MAPΔmptD) was characterized in vitro as well in vivo. In order to investigate the potential role of mptD, growth experiments in two different media were performed. Thereby, MAPΔmptD displayed a hampered growth in minimal medium compared to complex medium. Moreover, macrophages were infected to investigate the role in the host. The significantly reduced viability of MAPΔmptD indicated that the deletion mutant was significantly hampered regarding the adaptation to the macrophage environment. This important role of mptD was further supported in murine infection experiments where MAPΔmptD was significantly attenuated after peritoneal challenge. In order to determine the cause for the reduced virulence, transcriptome analysis and metabolic profiling were performed. Both methods demonstrated profound metabolic disorders especially in the lipid metabolism of MAPΔmptD. Overall, the data revealed that the mptD gene displayed an important factor for the metabolic adaptation of MAP required for persistence in the host.

The mptA contains further two putative Fur boxes in its promoter region. Hence, it was suggested that the inorganic metal uptake operon is regulated by FurA. The precise role of FurA in mycobacteria is not completely understood, so far. In MTB, FurA regulates its own expression and is co-transcribed with a catalase-peroxidase (KatG). KatG is induced upon oxidative stress and displays a major virulence factor for MTB since it counteracts the phagocyte oxidative burst. Consequently, it was suggested that FurA plays an important role in the oxidative stress response and is in turn also involved in the intracellular survival and persistence of pathogenic mycobacteria in the host. In MAP, a similar genetic organization of FurA and a strong homology to the FurA of MTB suggested a similar function. However, no characterization of FurA in MAP was performed, until now. Therefore, a furA knockout mutant (MAPΔfurA) was constructed by specialized transduction. Interestingly, the transcriptome analysis revealed a significant change in genes involved in metabolic adaption such as lipid metabolism in macrophages as well as biosynthesis of important virulence factors such as mycolic acid and stress response proteins. The in vivo effect of this different transcriptome pattern in MAPΔfurA was further analyzed. The animal experiments revealed lower levels of viable MAPΔfurA in the murine liver after peritoneal challenge, which highlighted the important role of FurA for biological fitness of MAP. Overall, our data demonstrated that the furA gene displays an important factor for the metabolic adaptation of MAP, especially in the antioxidant defense system, required for persistence in the host.

Altogether, both genes, the MAP-specific MptD and the archaic regulator FurA, are important for the virulence of MAP. It appears that MptD and FurA supported the metabolic adaption in macrophages and thus are also important for the survival in the host.

keywords

Mykobakterien, Virulenzfaktoren, MAP-spezifische Gene, Mycobacteria, MAP-specific genes, virulence factors 

kb

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