Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Maren Martin

Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104128

title (engl.)

Investigation about the influence of acute canine distemper virus infection on the function of ex vivo cultivated canine monocytes

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/martinm_ws13.pdf

abstract (deutsch)

 In der akuten Phase der Infektion mit dem kaninen Staupevirus (CDV) kommt es bei der neurologischen Verlaufsform klassischerweise zu einer Immunsuppression gefolgt von einer Demyelinisierung in der weißen Substanz des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Pathogenese der Demyelinisierung ist nicht abschließend geklärt, jedoch werden verschiedene Hypothesen postuliert. Zum einen kann der Zellmetabolismus der Oligodendrozyten durch eine CDV-Infektion direkt gestört werden, woraus eine Schädigung des Myelins resultiert (primäre Demyelinisierung). Zum anderen führt die CDV-Infektion zu einer Aktivierung der Mikroglia, welche als einen Mechanismus der unspezifischen Immunabwehr reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produziert. Oligodendrozyten sind besonders empfindlich gegenüber ROS und können als innocent bystander geschädigt werden, was ebenso zu einem Myelinschaden führen kann (sekundäre Demyelinisierung). Eine weitere vom Immunsystem initiierte Reaktion bei der CDV-Infektion ist die Rekrutierung von Monozyten aus dem peripheren Blut ins ZNS, wo sie sich zu Makrophagen wandeln. Sobald die Monozyten in das ZNS eingewandert sind, ist eine Differenzierung von der dort ansässigen Mikroglia schwierig. Daher ist nicht sicher zu bestimmen, was den Ursprung der ROS-Produktion darstellt, da die eingewanderten Monozyten genauso wie die Mikroglia zur ROS-Produktion befähigt sind und somit auch einen Beitrag zur Pathogenese der sekundären Demyelinisierung leisten können. Demnach war das Ziel dieser Arbeit die Hypothese zu belegen, dass CDV-infizierte Monozyten ROS produzieren und dass das Ausmaß dieser Produktion vom Virusstamm abhängig ist und somit den Einfluss auf das Immunsystem widerspiegelt.

Des Weiteren sollte die Isolation der Mikroglia optimiert werden, um eine Reinkultur mit Mikroglia für die Bearbeitung weiterer Fragestellungen zu etablieren. Zur Optimierung der Mikroglia-Isolation wurden verschiedene Protokolle angewendet und deren Effektivität mittels der Expression von CD11b, CD18 und CD45low durchflusszytometrisch bestimmt. Die Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender MACS-Separation lieferte die höchste Zellzahl mit der höchsten Reinheit und Vitalität der isolierten Mikroglia. Des Weiteren sollten die Bedingungen definiert werden, die es erlauben, Mikroglia in Reinkultur zu halten. Dazu wurden zwei Medien, Microglia Medium (MM-prf) und Sato-Medium jeweils mit und ohne Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (m-csf), verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kultivierung im MM-prf-Kulturmedium eine höhere Gesamtzellzahl, Reinheit und Vitalität der Mikroglia erzielte als im Sato-Medium. Dennoch wiesen die Mikroglia in der Reinkultur nach 24 Stunden eine sehr hohe Mortalitätsrate auf. Daher konnte eine Untersuchung der Mikroglia nur innerhalb der ersten 24 Stunden durchgeführt werden. Zur Untersuchung, ob Mikrogliazellen in vitro mit CDV infiziert werden können, wurden sie mit zwei verschiedenen Virusstämmen, dem attenuierten Onderstepoort (OND) und dem virulenten R252-Stamm, inkubiert. Interessanterweise konnte eine Infektion der Mikroglia mit dem R252 durchflusszytometrisch nachgewiesen werden, während eine Infektion mit dem Impfstamm OND nicht nachgewiesen werden konnte.

Zur Untersuchung der Monozyten wurde 10 ml Vollblut von zehn gesunden Beaglen entnommen und die Monozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die Monozyten wurden anschließend kultiviert und mit dem Impfstamm OND oder dem R252-Virusstamm infiziert und mit nicht-infizierten Monozyten als Negativkontrolle verglichen. Der Nachweis intrazellulären CDV-Antigens, die Expression von CD14 und die ROS-Produktion wurden direkt nach der Infektion (p.i.) und nach drei Stunden Inkubation (3 h p.i.) im Durchflusszytometer gemessen. Anders als bei der Mikroglia war eine Infektion der Monozyten mit beiden Virusstämmen möglich, wobei der R252 signifikant mehr Monozyten infizierte und zudem einen signifikant höheren virus load der Monozyten aufwies. Bei den CDV-infizierten Monozyten waren sowohl die Expression des Oberflächenmarkers CD14 als auch die Expressionsintensität im Vergleich zur nicht-infizierten Negativkontrolle signifikant aufreguliert. Neben einer Aufregulation von CD14 stimulierte die CDV-Infektion die Monozyten zur Generation von ROS, wobei interessanterweise die R252-infizierten Monozyten weniger ROS produzierten als die OND-infizierten und die nicht-infizierte Negativkontrolle.

Monozyten können das angeborene Immunsystem über den CD14/TLR4-Signalweg aktivieren und eine frühzeitige Elimination des Virus bewirken. Die hochgradig R252-infizierten Monozyten zeigten jedoch im Vergleich zu den geringgradig OND-infizierten Monozyten eine geringere Expression von CD14, was einen Mechanismus zur Entstehung einer Viruspersistenz darstellen könnte. Die ROS-Generation von CDV-infizierten Monozyten kann entscheidend zur Pathogenese der Demyelinisierung beitragen.

abstract (englisch)

The acute phase of canine distemper virus (CDV) infection is characterized by immunosuppression and demyelination in the white matter of the central nervous system (CNS). The pathogenesis of demyelination is still poorly understood. However, different hypotheses are postulated of which one sees a disturbance in the metabolism of the oligodendrocytes by the CDV infection as causative as it leads to damage of the myelin sheaths (primary demyelination). Another hypothesis considers microglial activation due to the CDV infection as a central role. Activated microglia generates reactive oxygen species (ROS) as a mechanism of the non-specific immunity. Since oligodendrocytes are highly vulnerable to ROS they can be damaged as innocent bystanders and consequently also the myelin sheath will be damaged (secondary demyelination). Another mechanism initiated by the immune system is the recruitment of peripheral blood monocytes into the CNS. After the monocytes entered the CNS they change into tissue macrophages and their differentiation from microglia is complicated. As both, microglia and the invading monocytes are capable to generate ROS its source is indistinguishable. Therefore, monocytes could also play an important part in the pathogenesis of secondary demyelination. The aim of this study was to evaluate the ROS generation of peripheral blood monocytes in response to CDV infection as this can reflect the activation of the immune system. Moreover, the aim was to optimize the isolation protocol of microglia in order to establish a pure micoglia cell culture for further research on microglial reaction profile.

For optimizing the microglia isolation different protocols were applied and their effectivities were determined via the cells’ expression of CD11b, CD18 und CD45low using flow cytometry. Density gradient centrifugation with subsequent MACS separation revealed the highest cell yield, purity and vitality of the isolated microglia population. Additionally, the conditions had to be established that allow cultivation of a pure microglia cell culture. Therefore, two culture media, Microglia Medium (MM-prf) and Sato-Medium each with and without macrophage colony-stimulating factor (m-csf) were compared. It could be demonstrated that microglial cultivation with MM-prf media leads to a higher cell yield, purity and vitality compared to Sato-Medium. Nevertheless, the mortality rate of the microglia was very high after 24 hours in culture. Therefore, microglial characterization had to be performed within the first 24 hours of culturing. Two CDV strains, the virulent R252 strain and the attenuated Onderstepoort (OND), were used to test whether microglia could be infected in vitro. Interestingly, only the R252 could be detected in microglia whereas no infection could be confirmed with OND.

For the characterization of monocytes 10 mL of whole blood was collected from 10 healthy Beagle dogs and isolated using density gradient centrifugation. The monocytes were cultured and infected with either the vaccine strain OND or the demyelinating strain R252 and the results of their characterization compared to that of non-infected monocytes that served as negative control (ctr). The intracellular CDV-antigen, the expression of CD14, and the ROS production were measured using flow cytometry directly post infection (p.i.) and three hours post infection (3 h p.i.). In contrast to the trial with microglia both virus strains were able to infect the isolated monocytes. However, the R252 strain infected significantly more monocytes with a significantly higher virus load compared to OND. The CDV-infected monocytes showed a significant up-regulation of the CD14 expression and expression intensity compared to the non-infected controls. Moreover, the CDV infection stimulated the monocytes to generate ROS. Interestingly, the R252-infected monocytes generated less ROS than the OND-infected and the non-infected monocytes.

Monocytes can activate the innate immunity via the CD14/TLR4 signaling pathway and eliminate the virus early in the course of the disease. However, the severely R252-infected monocytes showed a distinctly lower CD14 expression than the OND-infected monocytes which might represent a mechanism for the development of virus persistence. The ROS generation of CDV-infected monocytes may have an essential role in the pathogenesis of demyelination.

keywords

Monozyten, Staupevirus, Demyelinisierung, monocytes, canine distemper virus, demyelination

kb

1.496