Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Roberto Mancini

Detection of Y-chromosome bearing bovine sperm using laser-generated gold

nanoparticle bio-conjugates

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106638

title (ger.)

Detektion Y-Chromosomen boviner Spermien durch laser-generierte Gold Nanopartikel-Biokonjugate

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/mancinir_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Diese Studie beschreibt zwei innovative Aspekte der molekularen Biologie, Triplex-bildende Oligonukleotide (TFOs) allein und konjugiert mit Gold-Nanopartikeln. Ziel der Arbeit war es, eine neue Methode für die spezifische Genommodifikation von Spermien und deren Anwendbarkeit beim Sperma-Sexing zu entwickeln, die auf der Lebend-Detektion von Gensequenzen basiert.

 

Neben der Nutzung anderer DNA-detektierender Marker stellen Triplex-bildende Oligonukleotide eine alternative Methode für die spezifische Gendetektion in vitalen Zellen dar. Das Gelingen der Triplex-basierten Chromosomen-Markierung wird durch die Bindung spezifischer Oligonukleotide erzielt. In dieser Arbeit wurden mehrere Zielsequenzen für Triplex-Sonden auf dem bovinen Y-Chromosomen gefunden. Damit ist die Triplex-Hybridisierung auch für die Detektion von Y-Chromosomen-tragende Spermien eine zuverlässige Methode .

Drei ausgewählte TFOs, die eine Länge von circa 20 Basen aufwiesen, wurden in Hinblick auf ihre Hybridisierungseffizienz mit bovinen Y-Chromosomen analysiert. Eine bessere Hybridisierungsfähigkeit der Triplex-Sonden wurde durch die simultane Nutzung mehrerer Sonden erreicht.

 

Nicht alle Y-Chromosome tragenden Spermien konnten mit TFOs markiert werden. Dieses ist höchstwahrscheinlich auf den DNA-Kondensierungsrad zurückzuführen. Diese Studie bestätigt, dass für TFOs mit niedrigem Cytosingehalt eine höhere Hybridisierungstemperatur notwendig ist.

Um das Hybridisierungspotential von TFOs für zukünftige Studien festzulegen, ist es nötig, weitere Variablen zu berücksichtigen, beispielsweise die Koinkubationszeit für die Ziel-DNA mit den TFO-Sonden, die Inkubationstemperatur, die Sequenz der TFOs und ihr Methylcytosingehalt, die Art der Puffer und individuelle Sequenzvariationen zwischen verschiedenen Bullen.

 

Gold-Nanopartikel, die mit TFOs konjugiert sind, können mit genomischer DNA, die frei in Lösung ist, hybridisieren und führen zu einer Plasmon-Resonanz-Verschiebung (SPR). Die Anwendung dieser Konjugate mit Spermienchromatin führte nicht zu einem signifikanten Signalunterschied. Weitere Studien sind nötig, um Konjugate mit Gold Nanopartikeln verschiedener Größe (2 bis 50 nm) und ihre mögliche Anwendbarkeit für kondensierte Chromatinstrukturen zu identifizieren.

abstract (englisch)

This study describes two innovative aspects of molecular biology, triplex-forming-oligonucleotides (TFOs) alone and labeled to gold nanoparticles. The thesis aims to develop a novel approach for sperm gene targeting and its applicability to sperm sex sorting, based on vital genetic sequences detection.

 

Besides the use of other markers that recognize DNA, triplex-forming oligonucleotides represent an alternative approach for specific gene detection suitable for vital cells. The success of the triplex-based chromosome targeting is governed by the specific oligonucleotide binding.

Within this thesis an abundance of triplex target sites were found on the bovine Y-chromosome, which makes the triplex hybridization a valid alternative for Y-chromosome bearing sperm detection.

Three candidate TFOs, with a length of circa 20 bases, were analyzed for hybridization efficiency on the bovine Y-chromosome. Better triplex hybridization efficiency was achieved using more probes simultaneously.

Not all Y-chromosome sperm nuclei were detected by TFOs, most likely due to the intrinsic condensed DNA structure.

This study confirms that TFOs with a low content of cytosine have a higher hybridization temperature.

To define TFOs hybridization for future studies, it is necessary to consider further variables, such as time of incubation of target DNA and TFO probes, temperature, TFO’s sequence and 5- methylcytosine content, buffer and bovine individual sequence variations.

 

Gold nanoparticle conjugated with TFOs can hybridize to genomic DNA free in solution and lead to a surface plasmon resonance shift. The use of the conjugate in sperm chromatin resulted in a non-significant signaling.

More studies are needed to identify different sized AuNPs (from 2 nm to 50 nm) conjugates and their potential use in a condensed chromatin structure.

keywords

Goldnanopartikel, Spermiensortierung, gold-nanoparticle, sperm sorting

kb

2.390