Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Janine Maaß

 

Angeborene Immunität im bovinen Uterus: Phänotypische und funktionelle Eigenschaften uteriner monozytärer Zellen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103289

title (engl.)

Innate immunity in the bovine uterus: phenotypical and functional properties of uterine monocytic cells

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/maassj_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Funktionell unterschiedliche Makrophagensubtypen sind nicht nur an der Immunantwort gegen invasive Krankheitserreger beteiligt, sie tragen auch entscheidend zur Resolution einer Entzündung und Gewebeneubildung bei. Makrophagen-Heterogenität spielt im Zuge zahlreicher Erkrankungen eine bedeutende Rolle und ist deshalb im humanen und murinen System bereits gut erforscht. Über die Plastizität boviner Makrophagen, vor allem im bovinen Uterusgewebe, ist jedoch wenig bekannt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden in bovinem Uterusgewebe von uterusgesunden, subklinisch und klinisch erkrankten Tieren die Makrophagen-assoziierten Proteine S100A8/A9 (MAC387) und CD163 (AM-3K) nachgewiesen. CD163+ Zellen, zum Teil mit einer spindelförmigen Morphologie, waren in großer Anzahl im lockeren Bindegewebe der Lamina propria lokalisiert, während S100A8/A9+ Zellen sich in größerer Anzahl subepithelial und bei klinisch erkrankten Tiere auch im Epithel befanden. CD163+ Zellen waren geringfügig häufiger bei subklinisch erkrankten als bei uterusgesunden Tieren feststellbar, während deutlich mehr S100A8/A9+ Zellen bei klinisch und subklinisch erkrankten Kühen im Vergleich zu uterusgesunden Tieren detektiert werden konnten. Diese Unterschiede zwischen den Tiergruppen reflektierten sich nicht in einer unterschiedlichen mRNA-Expression der analysierten Gene (CXCL1, CXCL8, CCL5, TNF-a, S100A8/A9, iNOS, Arginase 1 und CD163) von bovinem Uterusgewebe nach quantitativer rtPCR. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden mononukleäre Zellsubpopulationen des Blutes mittels Membranimmunfluoreszenz phänotypisch charakterisiert, um zu prüfen, ob sich die im bovinen Uterusgewebe festgestellte Heterogenität der monozytären Zellen im peripheren Blut widerspiegelt. Die Zahl an Gesamtleukozyten, MNC und lymphoiden Zellen war dabei im Vergleich zu den uterusgesunden Kühen bei den subklinisch erkrankten Tieren signifikant erhöht. Unter den lymphoiden Zellen wiesen subklinisch erkrankte Tiere signifikant mehr B-Zellen (CD172a-CD21+) und CD335+ NK-Zellen auf, von denen ausschließlich die CD2- NK-Zellen signifikant erhöht waren. Unterschiede zwischen CD4+ T-Zellen, CD25+CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen und WC1+ ?d-T-Zellen bestanden nicht. Subklinisch erkrankte Tiere wiesen signifikant mehr CD172a+ Monozyten auf, wobei sich die Zahlen klassischer (CD14++CD16-), intermediärer (CD14+CD16+) und nicht-klassischer Monozyten (CD14-CD16+) nicht signifikant unterschieden. Um zu ermitteln, ob Unfruchtbarkeit, wie sie nach subklinischen Uteruserkrankungen auftritt, mit der Anzahl und Verteilung mononukleärer Subpopulationen im peripheren Blut assoziiert ist, wurden Blutzellen von Tieren, denen am Tag 7 nach der Ovulation ein Embryo eingesetzt wurde, phänotypisch charakterisiert. Während sich die Zahl der Gesamtleukozyten, der MNC und der lymphoiden Zellen nicht signifikant zwischen fruchtbaren und mehrmalig nicht trächtig gebliebenen Rindern unterschied, wiesen Tiere, die sowohl beim ersten als auch zweiten Embryotransferzyklus nicht trächtig geworden waren, eine signifikant höhere Anzahl an CD172a+ monozytären Zellen auf als Tiere, bei denen eine Trächtigkeits-Induktion möglich war. Unterschiede zeigten sich auch in den Monozytensubpopulationen. Dabei waren die Unterschiede besonders stark bei den CD14++ und CD163+ Monozytensubpopulationen. Damit scheinen erhöhte Monozytenzahlen im Blut mit Unfruchtbarkeit korreliert zu sein. Abkömmlinge der Blutmonozyten stellten sich immunhistologisch zum Teil als spindelförmige CD163+ Zellen dar. Um zu prüfen welche funktionellen Eigenschaften sog. MdF besitzen wurden bovine Monozyten unter dem Einfluss verschiedener Zytokine (IL-4, IL-13, IFN-?) in serumfreiem Medium zu MdF (monocyte-derived fibrocytes) sowie in I10F+ zu MdM (monocyte-derived macrophages) differenziert und anschließend mit LPS stimuliert. Die differentielle Reaktivität von MdF und MdM zeigte sich in einem unterschiedlichen Effekt des Primings. In MdF erhöhte das Priming mit IFN-? signifikant die Basisexpression der Gene CXCL1, CXCL8 und iNOS. Bei IFN-?-geprimten MdM war die Basisexpression der Gene CXCL1 und IL-1ß signifikant erhöht. Das Priming mit IL-4 und IL-13 verringerte die IL-1ß-Expression von MdM, während es in MdF zu einer erhöhten Basisexpression von TNF-a führte. Nach LPS-Stimulation unterschied sich die Reaktivität der MdF und MdM. Die Genexpression von IL-1ß, TNF-a und iNOS war in MdM durch LPS-Stimulation leichter und stärker (IL-1ß und iNOS) induzierbar als in MdF. Während CXCL1 und CXCL8 in ungeprimten MdM stärker exprimiert wurden als in ungeprimten MdF, war bei IL-4 und IL-13 sowie IFN-? geprimten Zellen die CXCL1- und CXCL8-Expression nach LPS-Stimulation in MdF stärker als in MdM. Die Zusammensetzung monozytärer Zellen im Uterusgewebe uterusgesunder sowie subklinisch und klinisch erkrankter Tiere weist somit neben CD163+ und S100A8/A9+ Makrophagen aufgrund der In-vitro-Befunde auch auf spindelförmige CD163+ MdF hin, die ein anderes Reaktionsspektrum aufweisen als klassische Makrophagen. Da Monozyten im uterinen Gewebe in funktionell unterschiedliche Effektorzellen differenzieren, welche die Gesamt-Reaktivität des Gewebes nach Erregerkontakt beeinflussen, können die gewonnenen Erkenntnisse mittelfristig dafür verwendet werden, prophylaktisch die gezielte Besiedelung durch monozytäre Zellsubpopulationen im bovinen Uterus zu steuern.

 

abstract (englisch)

Functional macrophage heterogeneity plays a crucial role in the defense against invading bacteria. Due to the functional and phenotypical variety of monocytes and macrophages, they also have an important impact on the resolution of the inflammation and tissue remodeling. Macrophage plasticity has long been recognized in numerous diseases and is well investigated in humans and mice. Little is known about functional polarization of macrophages in the bovine system. In this study, the expression of the macrophage associated proteins S100A8/A9 (monoclonal antibody MAC387) and CD163 (monoclonal antibody AM-3K) was analyzed in bovine uterine tissue of healthy animals, animals with subclinical and clinical endometritis. Positive cells showed differential distribution patterns: CD163+ cells, in part spindle-shaped, were preferentially located in the connective tissue of the Lamina propria whereas S100A8/A9+ cells were more abundant in subepithelial locations. There were notably more S100A8/A9+ cells in clinical and subclinical cows compared to cows with no uterine disease but only slightly more CD163+ cells in uterine tissue of subclinical cows in comparison to cows with a healthy uterus. We also examined different macrophage subsets in mid-lactating cows in order to analyze the influence of the lactation cycle. Mid-lactating animals showed a seam of only few but clearly detectable S100A8/A9+ cells right beneath the epithelium. Differences between animal groups were not reflected in a different mRNA expression of qRT-PCR analyzed genes (CXCL1, CXCL8, CCL5, TNF-a, S100A8/A9, iNOS, Arginase 1 und CD163) in bovine uterine tissue With purpose to find evidence for the uterine macrophage heterogeneity in peripheral blood, blood mononuclear cell subpopulations were phenotypically characterized by membrane immunofluorescence. Numbers of leukocytes, mononuclear cells and lymphoid cells were significantly higher in subclinical cows compared to cows with no uterine disease. The subclinical cows displayed an increased number of B cells (CD172a-CD21+) and CD335+ NK cells among the lymphoid cells. In terms of CD335+ NK cells, significantly more CD2- NK cells were detected in the peripheral blood of subclinical animals. No differences were found for CD4+ T-cells, CD25+CD4+ T-cells, CD8+ T-cells and WC1+ ?d-T-cells. CD172a+ monocytes were significantly increased in subclinical cows, while no differences to uterus-healthy cows were observed in the count of classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14+CD16+) and non-classical monocytes (CD14-CD16+). Since subclinical endometritis is often accompanied by infertility, it was evaluated whether there is a correlation between infertility and the composition of mononuclear blood cell. For this, blood mononuclear cells of heifers were analyzed which had an embryo transfer on day 7 after ovulation by membrane immunofluorescence. Individuals that failed pregnancy repeatedly displayed an increased number of CD172a+ monocytic cells when compared to individuals which developed a successful pregnancy. Among monocyte subpopulations, infertile animals displayed significantly higher CD14++ and CD163+ monocyte numbers. Thus, higher blood monocyte numbers are tentatively correlated with infertility. Blood monocyte descendants sometimes appeared as CD163+ spindle-shaped cells after immunohistology. To analyze the functional properties of so-called monocyte-derived fibrocytes (MdF), bovine monocytes were differentiated in the presence (priming) of cytokines (IL-4, IL-13, IFN-?) in serum-free medium into MdF and in serum-containing medium into monocyte-derived macrophages (MdM). MdF and MdM were stimulated with LPS. The differential reactivity of MdF and MdF showed up in a differential priming effect. In MdF, IFN-? priming significantly raised the baseline expression of CXCL1, CXCL8 und iNOS, whereas in MdM CXCL1 and IL-1ß were higher expressed. Priming with IL4/IL-13 lowered IL-1ß expression of MdM, while MdF displayed a higher TNF-a baseline expression. After LPS stimulation the response also differed between MdF and MdM. Compared to MdF, gene expression of IL-1ß, TNF-a and iNOS was faster and stronger (IL-1ß und iNOS) inducible in MdM. While CXCL1 and CXCL8 were higher expressed in unprimed MdM, IL-4/IL-13 and IFN-?-primed MdF showed a stronger CXCL1 and CXCL8 expression after LPS stimulation compared to cytokine-primed MdM. Thus, the population of monocyte-derived cells in uterine tissues is composed of CD163+ and S100A8/A9+ macrophages as well as – supported by the in vitro data – spindle-shaped CD163+ monocyte-derived fibrocytes. The latter show a different response type compared to macrophages with classical morphology. Since immigrating monocytes differentiate to functionally and phenotypically different effector cells in uterine tissues which govern the tissue reactivity after pathogen contact, the results may be used to direct the composition and differentiation of monocytic precursors in uterine tissue in a prophylactic manner.

 

keywords

Endometritis, Monzyten, Rind; endometritis, monocytes, cattle

kb

2.909