Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Carlos Luna-Tortós
Evaluation of transport of antiepileptic drugs by efflux transporters (multidrug transporters) of the blood-brain barrier
NBN-Prüfziffer	urn:nbn:de:gbv:95-98009
title (ger.)	Untersuchung des Transports von Antiepileptika durch Efflux-Transporter (Multidrug-Transporter) der Bluthirn-Schranke
publication	Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009
text	http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/luna-tortosc_ws09.pdf
abstract (deutsch)	Epilepsie ist eine der bedeutendsten Krankheiten des Zentralnervensystems, die ca. 50 Millionen Menschen weltweit beeinträchtigt. Die pharmakologische Behandlung gilt als die erste Wahl zur Therapie epileptischer Patienten. Allerdings erweisen sich ca. ein Drittel der Patienten als resistent gegenüber den momentan verfügbaren Antiepileptika. Eine Hypothese, die schon intensiv untersucht wurde, ist die so genannte Multidrug-Transporter-Hypothese. So konnte eine Überexpression von Vertretern der ATP-binding-Cassette (ABC) Transporterproteine, wie zum Beispiel von P-Glycoprotein und von Mitgliedern der Multidrug-resistance-associated Proteine (MRPs), im epileptogenen Fokus von pharmakoresistenten humanen Patienten und in Tiermodellen der Temporallappenepilepsie, sowie bei Tieren, die nicht auf medikamentöse Behandlung ansprachen, nachgewiesen werden. Obgleich die Bedeutung dieses Phänomens nicht vollständig geklärt ist, wurde in Tiermodellen für Epilepsie an der Ratte gezeigt, dass diese Transporterproteine die Konzentration von Antiepileptika in den epileptogenen Hirnregionen verringerten. Die Hemmung der Transporter resultierte in einer wiederhergestellten Ansprechbarkeit der zuvor pharmakoresistenten Ratten gegenüber den Substanzen. Dies deutet darauf hin, dass Transporter eine wichtige Rolle für den Auswärtsstrom von Substanzen aus dem Hirngewebe ins Blut spielen und die Konzentration von Antiepileptika am Ort ihrer Wirkung vermindern. Allerdings ist die Bedeutung der ABC-Transporter-Überexpression bei epileptischen Patienten noch nicht geklärt. Daher war es unser Ziel, in vitro zu untersuchen, ob einige humane ABC-Transporter, wie P-Glycoprotein, MRP1, MRP2 und MRP5, Antiepileptika transportieren. Zunächst etablierten wir eine modifizierte Version des weit verbreiteten Transwell-Assays und zeigten deren Anwendbarkeit für Substanz-Transport-Experimente. Mit Hilfe dieses Models konnten wir nachweisen, dass die Antiepileptika Topiramat, Phenytoin, Phenobarbital, Lamotrigin und Levetiracetam Substrate von humanem P-Glycoprotein, aber nicht von MRP1, MRP2 oder MRP5 sind. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass die Überexpression von Pgp an der lumenwärts gerichteten Endothelienmembran der Blut-Hirn-Schranke für den erhöhten Substanzefflux im Gehirn epileptischer Patienten verantwortlich sein kann. In Gegensatz dazu scheinen Carbamazepin und Valproinsäure nicht zu den Substraten von P-Glycoprotein zu zählen. Auf der anderen Seite sollten weitere Untersuchungen zu den MRP-Transportern durchgeführt werden, bevor die genannten Antiepileptika als MRP-Substrate verworfen werden, denn die Versuche zur Bestimmung des Transports durch MRPs wurden mit MDCK II Zellen durchgeführt, die eine hohe parazelluläre und transzelluläre Permeabilität aufweisen. Experimente mit Transporter-Hemmstoffen in LLC-PK1 Zellen zeigten, dass Valproinsäure ein Substrat für endogene MRPs ist, aber möglicherweise nicht für humane MRP1, MRP2 oder MRP5. Ausserdem konnten Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke mit humanem MDR1 erfolgreich transfiziert werden, so dass sie funktionelles Pgp exprimierten. Uptake-Experimente mit GPNT und RBE4 Zellen bestätigten den Transport von Phenytoin durch P-Glycoprotein. Allerdings sollte eine weitergehende Standardisierung dieser Modelle durchgeführt werden, um sie zur Untersuchung anderer Antiepileptika anzuwenden.
abstract (englisch)	Epilepsy is a major central nervous system disease affecting about 50 million people worldwide. While the pharmacological treatment is the main therapeutic option for the management of epileptic patients, about one third of them are considered to be refractory to the currently available antiepileptic drugs (AEDs). One of the mostly investigated hypotheses for explaining this phenomenon is the multidrug transporter hypothesis. Over-expression of several members of the ATP-binding cassette (ABC) transporters, such as Pgp and several multidrug resistance-associated proteins (MRPs) has been identified in epileptogenic focus of both drug-refractory human patients and (non responder) animal models of temporal lobe epilepsy. Although the significance of this phenomenon is not completely understood, it has been shown that in animal models of epilepsy efflux transporters reduce the concentration of major AEDs in the epileptogenic brain areas, and the inhibition of these transporters can reverse the nonresponder condition, implying that they play a major role in drug efflux from brain to blood, and reduce AED concentration in the site of action. However, the significance of ABC transporters over-expression in human beings is not known as yet. Hence, it was our aim to investigate whether several human ABC transporters, namely Pgp and MRP1, MRP2 and MRP5 transport AEDs in vitro. First, we were able to validate a modified version of the widely used Transwell assay, demonstrating its functionality for drug-transport experiments. With this model we could demonstrate that the AEDs topiramate, phenytoin, phenobarbital, lamotrigine and levetiracetam are substrates for human Pgp, but not for MRP1, MRP2 or MRP5. This results support the hypothesis that the overexpression of Pgp at the lumen of the blood-brain barrier endothelium may account for increased drug efflux in brain of human patients. Contrarily, carbamazepine and valproic acid do not seem to be substrates for human Pgp. On the other hand, given the high paracellular and transcellular permeability of the MDCK II cell model (which was used for assessment of MRP transport), further analysis with these transporters should be performed before discarding the former AEDs as substrates for MRPs. Experiments in LLC-PK1 cells also indicated that valproic acid is a substrate for endogenous MRPs, but probably not for human MRP1, MRP2 or MRP5. Finally, experiments performed with brain capillary endothelial cells show that they can be transfected with human MDR1 and express functional protein. Uptake experiments in GPNT and RBE4 cells confirmed transport of phenytoin by Pgp. However, further standardization of these models need to be performed, in order to employ them for the evaluation of other AEDs.
keywords	P-glycoprotein, Antiepileptika, Bluthirn-Schranke; P-glycoprotein, antiepileptic drugs, blood-brain barrier.
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