Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Florenza Lüder Ripoli

 

 Comparison of fresh frozen vs. formalin-fixed, paraffin-embedded specimens and the expression profiling of 16 target genes in neoplastic and non-neoplastic canine mammary tissues using a multiplex branched-DNA assay

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109293

title (eng.)

Vergleich von kryokonservierten und Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Mammagewebe des Hundes und die Expressions-Analyse von 16 Target-Genen mittels Multiplex Branched-DNA Assay

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/luederripolif_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Mammatumoren sind die häufigste Neoplasie der Hündin. Dabei kommen sie bei bestimmten Rassen gehäuft vor. Die Anwendung von Tumormarkern bei Brustkrebs ist bereits intensiv untersucht worden und manche Gene werden beim Menschen bereits routinemäßig als prädiktive, diagnostische und prognostische Marker oder für Therapie-Optionen genutzt. Der Einsatz von Tumormarkern bei kaninen Mammatumoren ist jedoch zurzeit nur für Forschungszwecke von Bedeutung. Dementsprechend werden in der vorliegenden Studie Genprofile in verschiedenen Mammatumorentitäten des Hundes untersucht, um potenzielle prognostische oder prädiktive Marker zu finden.

Für die vorliegende Studie wird zur Genexpressionsanalyse aus Mammagewebe des Hundes ein  Branched DNA Assay für kryokonservierte und FFPE-Proben verwendet. Das Branched DNA Assay ermöglicht die Analyse von Proben mit geringer Menge an RNA  (dementsprechend passend für die Untersuchung von wertvollen FFPE-Proben), sowie die gleichzeitige Analyse von mehreren Target-Genen in einer Probe. Gründe für die vorliegende Untersuchung waren: (i) festzustellen, ob FFPE-Proben, die im Rahmen von histopathologischen Untersuchungen als archiviertes Material einen großen Probenpool darstellen, für zukünftige Genexpressions-Analysen mit dieser Methode gemessen werden können; (ii) die Vorteile der genutzten Methode mit anderen Methoden, wie IHC oder qPCR, zu diskutieren. Deshalb wurde untersucht, ob die gemessene Genexpression zwischen kryokonservierten und FFPE-Proben mit dem b-DNA-Assay vergleichbar ist, und ob die verschiedenen Lagerungszeiten der Proben einen Einfluss auf die Genexpression haben. Zusätzlich wurden die Ergebnisse von drei unterschiedlichen Housekeeping-Genen bewertet.

Insgesamt zeigte die angewendete Methode sowohl für kryokonservierte, als auch für FFPE-Proben weitgehend verlässliche Ergebnisse im Mammagewebe des Hundes. Die relative Genexpression der beiden Probenarten zeigte, unter Verwendung des Mittelwertes von drei Housekeeping-Genen, eine Übereinstimmung von 63%. Hierbei muss beachtet werden, dass FFPE-Proben allgemein eine niedrigere Expression zeigten als die kryokonservierten Proben. Als eine Ursache dafür wurde die Lagerungszeit vermutet. Der daraufhin durchgeführte Vergleich von drei verschiedenen Lagerungszeiten von FFPE-Proben ergab, dass eine eindeutig höhere Expression der Target-Gene in der Gruppe der Proben mit kürzerer Lagerungszeit vorlag, während die Expression in den anderen beiden Gruppen mit der Zeit abnahm. Im Bezug auf die eingesetzten Housekeeping-Gene stellte sich heraus, dass ACTB für die Normalisierung der Daten am wenigsten Unterschiede zwischen kryokonservierten und FFPE-Proben im Vergleich der Genexpression innerhalb der histologischen Gruppen  zeigte, gefolgt von HPRT1 und GAPDH.

Die Erkenntnis, dass sowohl kryokonservierte, als auch FFPE-Proben von kaninem Mammagewebe verlässliche Ergebnisse liefern, war ein wichtiger Befund für die Analyse verschiedener Target-Gen-Expressionen in neoplastischem (gutartig und bösartig) und nicht-neoplastischem Mammagewebe mit dem Ziel potentielle Tumormarker zu detektieren.  16 Onko- und Tumorsuppressorgene (BRCA1; BRCA2; FOXO3; GATA4; HER2; HMGA1; HMGA2; HMGB1; MAPK1; MAPK3; MCL1; MYC; PFDN5; PIK3CA; PTEN und TP53), welche bei der Entwicklung von Neoplasien der Mamma eine Rolle spielen, wurden in der vorliegenden Studie mittels Multiplex Branched DNA Assay untersucht. Da auch Hormonrezeptoren eine wichtige Bedeutung bei Brustkrebs beim Menschen besitzen, wurde die Expression von ER, PR, PRLR und GHR in der vorliegenden Studie zeitgleich mitgemessen. Die Ergebnisse und deren Diskussion waren aber Teil einer weiteren Studie. 

Aufgrund der Tatsache, dass lediglich eine Übereinstimmung von 63% im ersten Teil der Studie vorhanden war, wurden kryokonservierten und FFPE-Proben getrennt voneinander analysiert.

Die in der vorliegenden Studie festgestellte signifikante Abnahme der Expression von den Tumorsuppressor-Genen TP53, FOXO3, PTEN und PFDN5 in malignen Tumoren bestätigt Ergebnisse früherer Studien und unterstreicht die Bedeutung der genannten Gene beim Zellwachstum. Dabei wurde die FOXO3-Expression in der vorliegenden Studie erstmalig im Zusammenhang mit kaninen  Mammatumoren gemessen. Dementsprechend haben diese vier Gene das Potenzial als Tumormarker bei Mammatumoren des Hundes genutzt zu werden. Im Gegenteil zu dem was beim Menschen festgestellt wurde, wiesen die Gene HMGA1, HMGB1, MCL1, MAPK3 und PIK3CA, welche das Zellwachstum stimulieren sollen, eine durchweg niedrigere Expression in malignen Mammatumoren auf. Ensprechend könnten sie in Mammatumoren des Hundes eine andere Aufgabe einnehmen, als beim Menschen.

Die Multiplex-Branched-DNA-Technologie stellt definitiv eine Methode dar, welche die Analyse von mehreren Proben mit einer geringen Menge an Startmaterial von kryokonservierten und FFPE-Proben ermöglicht. Dennoch muss beachtet werden, dass FFPE-Proben im Allgemeinen eine niedrigere Expression der analysierten Target-Gene aufweisen, als aus kryokonservierten Proben. Dabei spielt die Lagerungszeit eine Rolle. In der vorliegenden Studie wurde, im Vergleich mit anderen Studien, eine größere Zahl an Proben analysiert wodurch entsprechend eine verlässlichere Aussage zu erwarten ist.

Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Studie, können die Tumorsuppressor-Gene TP53, FOXO3, PTEN und PFDN5 als potenzielle Marker für das Verhalten von Mammatumoren beim Hund angesehen werden. Der Vergleich der Expressionsmuster der Target-Gene in neoplastischem (benigne und maligne Tumoren) und nicht-neoplastischem Gewebe könnte für das bessere Verständnis der Tumorpathogenese in verschiedenen kaninen Mammatumor-Untergruppen in zukünftigen Studien von Bedeutung sein. Zusätzlich könnten die potenziellen Target-Gene Grundlagen sein herauszufinden, warum verschiedene Rassen eine Prädisposition für Mammatumoren haben. Die Identifikation von geeigneten Target-Genen bietet auch die Voraussetzung in der Zukunft nach  gentherapeutischen Ansätzen zu forschen.

 

abstract (englisch)

Mammary gland tumors are one of the most common neoplasms in female dogs and certain breeds are prone to develop the disease. The use of markers in human BC has been widely studied and some genes are routinely used as predictive, diagnostic and prognostic factors as well as for treatment reasons. The use of biomarkers in CMT is, however, still restricted to research purposes only. Therefore, gene profiles in different canine mammary entities were analyzed in the present study in order to evaluate the strength of potential markers serving as future prognostic and predictive factors.

For this study, a branched-DNA assay was utilized to analyze the gene expression in FF and FFPE samples of canine mammary tissues. The b-DNA assay permits to analyze specimens with small amounts of RNA (and therefore suitable to analyze valuable FFPE specimens) as well as several target genes within a single sample. The reasons for the study were: (i) to analyze if valuable FFPE specimens, which represent a unique source of archived biological material, could be measured with the branched DNA assay; (ii) to discuss the advantages offered by the referred method when analyzing gene expression in comparison to techniques such as IHC and qPCR. Therefore, it was of interest to determine whether the gene expression between FFPE and FF specimens is comparable when applying the referred technique and whether the different storage times have any influence on the outcomes. Moreover, the opportunity to evaluate the performance of three different housekeepers in mammary canine tissues was taken.

Overall, the technique revealed to be feasible to analyze FF and FFPE samples of canine mammary tissues. The relative gene expression of the two different origins of samples showed an agreement of 63% when normalizing the data to the average of the three HKG. Still, care should be taken as FFPE specimens showed, in general, lower expression of the analyzed targets when compared to FF samples.
It was hypothesized that this finding is caused by the effect of storage time. The subsequent comparison among three different storage times of FFPE revealed a clearly higher expression of target genes in the short storage time group with a decrease in the expression in the other groups over time.
Regarding the different HKG, data normalized against ACTB was found to present the lowest significant difference between the FF and FFPE samples when comparing the histological groups followed by HPRT1 and GAPDH.

Bearing in mind that the technique showed to be feasible for the analysis of FF and FFPE samples in canine mammary tissues, it enabled us to analyze the gene expressions of different target genes in neoplastic (benign and malignant) and non-neoplastic tissues with the intention of finding new potential tumor markers. 16 onco- and suppressor-genes (BRCA1; BRCA2; FOXO3; GATA4; HER2; HMGA1; HMGA2; HMGB1; MAPK1; MAPK3; MCL1; MYC; PFDN5; PIK3CA; PTEN and TP53) regarded as being involved in neoplasm development were analyzed in the present study using a multiplex b-DNA assay. As hormone receptors also play an important role in human BC, the opportunity was taken to concomitantly analyze the gene expressions of ER, PR, PRLR and GHR herein. The results and discussion about them are, however, described in another work.

Considering that an agreement of 63% was revealed between FF and FFPE, the samples were analyzed separately.

The significant reduction in the expression of the tumor suppressors TP53, FOXO3, PTEN and PFDN5 in malignant tumors found in the present study confirms previous reports, underlining their role in cellular growth. This is the first study which analyzed the gene expression of FOXO3 in CMT.  Hence, these genes could represent potential markers for CMT. On the contrary to what is normally reported in humans, the genes HMGA1, HMGB1, MCL1, MAPK3 and PIK3CA, which are genes known to stimulate cellular growth, revealed to be consistently lower expressed in malignant tumor. Therefore, a hypothesis is raised whether those genes play a different role in canine mammary tumor.

The multiplex b-DNA technology is certainly a method which enables the analysis of several samples which present small amounts of RNA of FF and FFPE tissue. Still, care should be taken considering that FFPE specimens generally present a lower expression of the analyzed target genes when compared to FF samples, fact which is related to the storage time. In this work, a considerably larger number of samples was analyzed when compared to other studies performed in this field so far, permitting, consequently, a more reliable outcome.

Based on the outcomes of the present work, the suppressor genes TP53, FOXO3, PTEN and PFDN5 are considered as potential markers for the behavior of canine mammary tumors. The comparison of the expression patterns of the candidate genes in neoplastic (benign and malignant) and non-neoplastic tissues herein described might serve to gain a better understanding of the tumor pathogenesis of different canine mammary tumor subtypes in further studies. Moreover, potential target genes might assist to determine whether certain breeds are prone to develop CMT. The identification of suitable target genes offers the prerequisite to search for novel therapeutic approaches in the future, just like in the human counterpart.

 

keywords

Canine mammary tumor, gene expression, multiplex branched-DANN assay, Mammagewebe des Hundes, Expressions-Analyse, Multiplex, Branched-DNA Assay

kb

2.988