Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Christina Lorbeer

Optical imaging techniques for the study of cellular properties in developing neural systems

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110727

title (ger.)

Untersuchung von zellulären Eigenschaften in sich entwickelnden neuralen Systemen mit Licht

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/lorbeerc_ws17.pdf

abstract (deutsch)

In dieser Arbeit wurden drei verschiedene optische Verfahren auf ihre Eignung für unterschiedliche Probleme in Entwicklungsstudien, wie z. B. unterschiedliche Probengrößen, die schnelle Beurteilung pharmakologischer Daten und die Manipulation ausgewählter Zellen, getestet. Die drei Teile dieser Arbeit beschäftigen sich mit diesen Problemen.

Die Probendicke bestimmt die optische Technik, die für die Analyse des Präparates geeignet ist. Proben bis zu 100µm können durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden. Für Präparate von Submillimeterbereichen bis zu mehreren Millimetern ist die Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) verfügbar. Vor kurzem wurde eine Technik entwickelt, die für das Scannen größerer Proben geeignet ist, die Scanning Laser Optical Tomography (SLOT). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob sich SLOT für die Beurteilung von 3D-Daten von kleinen und mittelgroßen Proben eignet. Zusätzlich wurde evaluiert, ob SLOT für Manipulationsexperimente an sich entwickelnden neuralen Systemen verwendet werden kann.

Das Bauchmark und Gehirne von Drosophila melanogaster L3-Larven wurden als kleine Probe verwendet. Mittelgroße Proben waren die Gehirne und optischen Loben von Locusta migratoria L1 und L3 Larven. Die Manipulation der zellulären Neurotransmitterspiegel erfolgte über die Injektion des Medikaments Reserpin in Heuschreckenlarven des dritten Larvenstadiums. Reserpin verhindert die Wiederaufnahme aminerger Neurotransmitter wie zum Beispiel des Serotonins in die synaptischen Vesikel. In allen Proben wurden Serotonin mittels Immunfluoreszenz visualisiert. Es wurde demonstriert, dass SLOT eine geeignete Methode ist, um 3d-Datensätze von Fluoreszenz- und Durchlichtsignalen der zu analysierenden Proben zu erhalten. Einzelne Zellkörper sowie die Neuriten der serotonergen Neuronen wurden deutlich dargestellt. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass die Behandlung mit Reserpin dazu geführt hat, dass die Serotonin-Level in einigen, aber nicht allen serotonergen Neuronen, gesenkt wurde.

Im zweiten Teil wurde ein Modell für die neuronale Differenzierung gewählt, um die cytosolische Calciumdynamik im Verlauf neuronaler Differenzierung zu analysieren: die humane embryonale Stammzelllinie NT2 (Klon D1). Diese Experimente wurden mit der Entwicklung einer schnellen Screening-Technik auf der Basis von Calcium-Imaging kombiniert. Mittels eines Calcium-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs wurde die Reaktion von humanen NT2-Vorläuferzellen und Neuronen auf die Zugabe von Acetylcholin analysiert. Die nikotinischen Rezeptoren wurden durch d-Tubocurarin blockiert und die muskarinischen Rezeptoren durch Atropin. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass der cytosolische Calciumanstieg nach cholinerger Stimulation in NT2-Vorläuferzellen allein durch muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren induziert wurde. Mittels Calcium-Imaging wurde eine Veränderung des cholinergen Rezeptortyps aufgrund der Retinsäure-induzierten Differenzierung nachgewiesen: Die NT2 Neuronen haben entweder muskarinische oder nikotinische Rezeptoren.

Weiterhin wurde gezeigt, dass eine andauernde cholinerge Stimulation von NT2-Zellen während der neuronalen Entwicklung der Anteil an GABAergen Neuronen erhöht, während der Prozentsatz des cholinergen Phänotyps nicht verändert wird.

Neben der Erfassung von zellulären Eigenschaften gibt es optische Techniken, die für die Manipulation von Proben angewendet werden können. Die optische Stimulation von Neuronen ist eine neuartige optische Technik, die im Fokus der aktuellen Forschung steht. In Zellen, die keine photosensitiven Pigmente exprimieren, kann die optische Anregung über Infrarotstimulation erfolgen. Diese optische Stimulation kann dadurch verbessert werden, dass die Zellen mit Nanopartikeln beladen werden. Elektrisch leitende Nanopartikel konzentrieren die Energie des Laserlichts durch einen physikalischen Prozess, der Plasmonresonanz genannt wird. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die NT2 Vorläuferzellen und Neurone mit Laserlicht mit und ohne Nanopartikel angeregt. Die Fluoreszenz des Calcium-Sensor Fluo-4 AM wurde verwendet, um die Effekte dieser optischen Stimulation zu analysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die cytosolischen Calcium-Level in NT2 Zellen anstiegen, wenn die Zellen mit 532nm Laserpulsen angeregt werden. Wurden die Zellen mit 200nm Goldnanopartikeln behandelt, erfolgte in mehr Zellen eine Erhöhung der cytosolischen Calciumspiegel und der Anstieg des Calciumsignales war stärker. Darüber hinaus unterschied sich die Calciumantwort in NT2- Neuronen von den Calciumsignalen in NT2-Vorläuferzellen.

abstract (englisch)

In this thesis three different optical techniques were tested for their suitability to analyze problems in developmental studies, such as different sample sizes, the fast assessment of pharmacological data and the manipulation of selected cells. The three parts of this thesis deal with these problems.

The sample thickness restricts the optical technique that is appropriate for the sample analysis. Specimen up to 100 µm can be measured by confocal microscopy. For specimen of submillimeter range to several millimeters size, the Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) is available. Recently, a technique was developed that is suitable for scanning larger samples, the scanning laser optical tomography (SLOT). In this thesis, the suitability of SLOT for the assessment of 3-D data of small and midsized specimen was tested. Additionally, it was evaluated whether SLOT can be used for manipulation experiments on developmental neural systems.

The ventral nerve cords and brains of Drosophila melanogaster L3 larvae were used as small specimen. Mid-sized specimen were the Locusta migratoria L1 and L3 larva brains and optical lobes. The manipulation of cellular neurotransmitter levels was implemented via the injection of the serotonin depleting drug reserpine into L3 locust larvae. In all specimen, serotonin was visualized via immunofluorescence. It was shown that SLOT is suitable for the assessment of 3-D fluorescence and transmitted light data of the analyzed samples. Single cell bodies as well as the neurites of the serotonergic neurons were depicted clearly. Furthermore, the reserpine induced serotonin-depletion of a subset of neurons in the locust brains could be clearly shown.

A model for neuronal development was chosen to analyze cytosolic calcium dynamics during neuronal development: the human embryonal carcinoma cell line NT2 (clone D1). These experiments were combined with the development of a fast screening technique based on calcium imaging. The calcium-sensitive fluorescent dye Fluo-4 AM was used to analyze the calcium responses of the human NT2 precursor cells and neurons after stimulation with acetylcholine. The nicotinic receptors were blocked by d-tubocurarine and muscarinic receptors were inhibited by atropine. That way it was shown that the cytosolic calcium increase after cholinergic stimulation in NT2 precursor cells was induced solely by muscarinic acetylcholine receptors. By means of calcium imaging, a change of the cholinergic receptor type due to the retinoic acid induced differentiation was shown: The NT2 neurons either have muscarinic or nicotinic receptors.

Further, it was shown that a prolonged cholinergic stimulation of NT2 cells during the neuronal development increases the share of GABAergic neurons, whereas the percentage of the cholinergic phenotype is not altered.

Aside from the detection of properties, there are optical techniques that can be applied to manipulate specimen. A novel application is the optical stimulation of neurons that is in the focus of current research. In cells that do not express photosensitive pigments this can be done via infrared stimulation. The optical stimulation can be enhanced by nanoparticle treatment. The energy of the laser light is focused by electrically conducting nanoparticles via a physical process called plasmon resonance.

In the third part of this work the precursor cells and neurons derived from the human embryonic stem cell line NT2 clone D1 were excited with laser light with and without nanoparticles. The fluorescence of the calcium-sensor Fluo-4 AM was used to analyze the effects of this optical stimulation. The results show calcium responses after stimulation by 532 nm laser pulses. When the cells were treated with 200 nm gold nanoparticles more cells elevated their cytosolic calcium levels and the calcium increase was stronger. In addition, the calcium response in NT2 neurons differed from the calcium signals in NT2 precursor cells.

keywords

Calcium Imaging, Gold Nanopartikel, Fluoreszenztomografie ; calcium imaging, gold nanoparticles, fluorescence tomography

kb

24.362