Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Wen Liu

Stem cell marker expression of canine neoplasia generated cell subpopulations and effect of novel arylindolylmaleimides on canine lymphoma cell lines

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107405

title (ger.)

Stammzell Markerexpression von caninen Tumor Zellsubpopulationen und Charakterisierung des Effektes von Arylindolylmaleimiden auf canine Lymphom-zelllinien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/liuw_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Potentielle Tumorstammzellen werden als wichtige Zellpopulation bei Tumorentwicklung und Progress angesehen. Diese Zellen können bei einer Vielzahl Neoplasien des Menschen über spezifische Markermoleküle identifiziert und isoliert werden.

Im ersten Teil dieser Arbeit sollte die Expression von 12 Stammzellmarkern in Material aus caninen Lymphomen und Prostatakarzinomen charakterisiert werden. Ferner sollte evaluiert werden ob ein spezifisches Expressionsmuster identifiziert werden kann, welches die Detektion und Isolierung von potentiellen Tumorstammzellen erlaubt. Die 12 Marker wurden an asservierten Primärmaterial, den Zelllinien CLBL-1, CLBL-1M, CT1258 und daraus generierten Zellsphären analysiert. Für das MELK Gen konnte eine Überexpression in den primären caninen B-Zell- Lymphomproben als auch in den analysierten Zelllinien beschrieben werden. Die generierten Sphären der Lymphomals auch Prostatakarzinomzelllinien zeigten jedoch keine erhöhte Resistenz gegen Doxorubicin. Weiterhin konnte für die MYC Genexpression gezeigt werden, dass in Sphären der B-Zell-Lymphome die Expression erhöht war während sie in doxorubicinresistenten CLBL-1M also auch CT1258 generierten Sphären erniedrigt waren. Für CD44 konnte nur in den CLBL-1 und CLBL-1M generierten Sphären eine Erniedrigung der Expression gezeigt werden. DDX5 und MELK hatten in doxorubicinresistenten CLBL-1M und CT1258 generierten Sphären eine erniedrigte Expression. Für ITGA6 wurde eine erniedrigte Expression in CLBL-1M generierten Sphären detektiert, während in CT1258 generierten Sphären die Expression erhöht war. Außerdem zeigten die doxorubicinresistenten CLBL-1M Zellen eine erhöhte Expression des Stammzellmarkers NANOG. Zusammenfassend lässt sich behaupten, dass kein einheitliches Muster identifiziert werden konnte und dass die verschiedenen Zellpopulationen unterschiedliche individuell charakteristische Expressionsmuster aufweisen.

Um weiterführende Untersuchungen zu Pathomechanismen des caninen Prostatakarzinoms durchführen zu können, sind in dieser Arbeit stabil transfiziert fluoreszente CT1258 Zelllinien etabliert und charakterisiert worden. Die generierten Zelllinien CT1258-FusionRed, CT1258-mKate2C, und CT1258-TurboFP650 exprimieren Proteine, die im roten und nahinfraroten Bereich emittieren und somit für hochsensitive in vivo Imaging Aufnahmen genutzt werden können. Vergleichende Analysen der Zellproliferationsraten und der Stammzellmarkerexpression haben gezeigt, dass die Charakteristika der neu etablierten Zelllinien der parentalen Zelllinien gleichen. Copy Number Variation (CNV) Analysen und der Vergleich der metabolischen Aktivität haben weiterhin gezeigt, dass die fluoreszenten Zelllinien weitgehend der parentalen Linie entsprechen. Die Linie CT1258-mKate2C zeigte jedoch als einzige Line keinen distalen Verlust bei CFA16.

Die Evaluation von neuartigen therapeutischen Substanzen ist ein zentraler Punkt im Bereich der Tumorforschung. PDA-66 und PDA-377 repräsentieren zwei Arylindolylmaleleimidderivate, deren Effekte im Rahmen dieser Arbeit erstmals bei Lymphomzellen evaluiert wurden. PDA-66 und PDA-377 zeigten signifikante antiproliferative Eigenschaften bei caninen B-Zell-Lymphomzellen, der beobachtete Effekt ist klar dosisabhängig. Beide Substanzen induzieren sowohl Apoptose als auch Nekrose, wobei PDA-66 hier den stärkeren Effekt aufweist. Zur genaueren Charakterisierung der PDA-66 induzierten Effekte sind in der Folge vergleichende Transkriptomanalysen durchgeführt worden. Hierbei wurden unterschiedliche Zeitpunkte und Konzentrationen von PDA-66 verglichen. Eine 2,5µM Konzentration zeigte hier signifikante Änderungen im Genexpressionsmuster beider CLBL-1 Zell-linien. Die Gene der signifikant deregulierten Pathways gehören zur Zellzyklusregulation, DNA-Replikation und P53.

abstract (englisch)

Cancer stem cell (CSC) as the most critical population in cancer development was widely proven to distinguish with bulk of tumour cells using specific markers. Thus, the first part of this thesis was attempt to identify the candidate cancer stem cell marker genes in canine B-cell lymphoma and canine prostate carcinoma. The expression profiling of 12 stem cell associated genes was characterized in primary canine lymphoma samples, canine lymphoma cell lines CLBL-1 and CLBL-1M, canine prostate carcinoma cell line CT1258, and the generated stem cell-like subpopulation of CLBL-1, CLBL-1M and CT1258. MELK gene showed over-expression in canine B-cell lymphoma primary samples and CLBL-1/-1M cells in comparison to non-neoplastic lymph node control. The serum-free generated sphere cells did not display a doxorubicin resistant feature both in canine B-cell lymphoma and prostate carcinoma cells. Relative real-time PCR revealed MYC oncogene was up-regulated in serum-free generated canine B-cell lymphoma cells, whereas down-regulated in doxorubicin resistant CLBL-1M cells and CT258 generated sphere cells. CD44 down-regulation was only observed in CLBL-1 and CLBL-1M serum-free generated cells. DDX5 and MELK showed down-regulation in doxorubicin resistant CLBL-1M cells and CT1258 generated sphere cells. ITGA6 was found down-regulation in CLBL-1M serum-free generated cells, while up-regulation in CT1258 generated sphere cells. Up-regulation of NANOG was observed in doxorubicin resistant CLBL-1M cells. These observations, taken together, suggest that different subpopulations of tumour cells may have various gene expression patterns and reflect different stem cell characteristics.

For further understanding of the pathogenesis of prostate cancer, as well as investigating of CSC subpopulation, three CT1258 fluorescent cell lines were established. CT1258-FusionRed, CT1258-mKate2C, and CT1258-TurboFP650 stably express fluorescent proteins in red, far-red and near infra-red spectrum. The cell line fluorescence is highly sensitive detectable in vitro using an in vivo imaging system. Cell proliferation and stem cell marker genes expression results showed that the generated cell lines kept their parental cell line characteristics. In comparison to their parental cell line, genomic copy number variation (CNV) and metabolic activity showed in general no significant changes. CT1258-mKate2C was the only line without a distal CFA16 deletion and elevated metabolic activity. Nevertheless, the generated cell lines provided a valuable option for deep tissue in vivo imaging.

The discovery and development of new effective anticancer drugs are still the major focus of current cancer research. PDA-66 and PDA-377 are two newly synthesised arylindolylmaleimides, which were applied to the canine B-cell lymphoma cells for the first time in this thesis. PDA-66 and PDA-377 display significant antiproliferation effect in canine B-cell lymphoma cells in a strong dose dependent manner. Further analyses investigate that PDA-66 and PDA-377 could induce apoptosis and necrosis in canine B-cell lymphoma cells. Additionally, PDA-66 revealed more effective than PDA-377. Therefore, the transcriptomic analyses were performed on PDA-66 treated canine lymphoma cells. Gene expression was significantly different between 12 hours and 24 hours of 2.5 µM PDA-66 effects. These differentially expressed genes were mainly involved in the cell cycle, DNA replication, and p53 signalling pathways.

keywords

Tumorstammzellen, Lymphom, Arylindolylmaleimide; Cancer stem cell, lymphoma, arylindolylmaleimide

kb

7.091