Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Veronika Lippross

 

Objektive, nicht-invasive bildgebende Diagnostik der Neurodegeneration in transgenen Huntington-Ratten –

eine Follow-up-Studie mit Kleintier-PET und - MRT

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108269

title (engl.)

Objective non-invasive diagnostic imaging for neurodegeneration in transgenic Huntington rats - a follow-up study using small animal PET and MRI.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/lipprossv_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der Arbeit war, die Hypothese zu untersuchen, dass transgene Huntington-Ratten im Verlauf der Erkrankung bzw. ihrer Lebensspanne eine im PET und MRT messbare Neurodegeneration entwickeln. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, würde sich das Ratten-Modell für weitere Therapie- und Verlaufsstudien eignen.

 

Die Huntington‘sche Erkrankung gehört zu der wachsenden Gruppe der herediteren neurodegenerativen CAG-Triplet-Repeat-Erkrankungen, denen eine pathologische Verlängerung der Cytosin-Adenosin-Guanin-Sequenzen zugrunde liegt. Der mutierte Genabschnitt des HD-Gens befindet sich innerhalb einer Sequenz, die für das cytoplasmatische Protein Huntingtin (htt) kodiert. Wahrscheinlich durch die pathologische CAG-Verlängerung entwickelt das Huntingtin eine bislang nicht geklärte toxische Wirkung, die die Krankheitserscheinungen der Chorea Huntington induziert, ein als „Game of Function“ bezeichnetes Prinzip.

 

Die Chorea Huntington ist eine der häufigsten genetisch bedingten Erkrankungen beim Menschen. Sie ist gekennzeichnet durch den zunehmenden Verlust der motorischen Kontrolle und führt u.a. zu unkontrollierbaren Hyperkinesien, Dysdiadochokinese sowie zum Nachlassen der intellektuellen Fähigkeiten und psychiatrischen Symptomen wie Persönlichkeitsveränderungen, Gewaltbereitschaft, Wahnvorstellungen und Depressionen. Die Erkrankung, die sich typischerweise im Erwachsenenalter manifestiert, verläuft langsam progredient und führt innerhalb eines Zeitraums von meist 15 – 20 Jahren zum Tod des Betroffenen. Charakteristische pathologische Befunde sind Atrophien im Bereich der Hirnrinde und der Basalganglien, vor allem des Striatums. Im Verlauf der Erkrankung verliert das gesamte Hirn bis zu 30% an Gewicht.

 

Bei den Versuchstieren handelte es sich um 35 Sprague-Dawley-Ratten aus der

 

 

Arbeitsgruppe um Professor Dr. Stephan von Hörsten, Erlangen. Die 17 homozygot transgenen Tiere der Linie 2762 wurden mit 18 als nicht transgen getesteten Geschwistertieren verglichen. In das Genom der transgenen Ratten wurde das Huntington-Gen zufällig positioniert eingebracht. Die Tiere produzieren zusätzlich zum endogenen normalen Protein Huntingtin das krankheitsauslösende pathologische Protein. Das tgHD-Rattenmodell hat im Vergleich zu den bisher hauptsächlich verwendeten Maus-Modellen den Vorteil eines chronischen Phänotyps. Die tgHD-Ratten haben im Gegensatz zu den früher eingesetzten Mäusen eine Lebenserwartung von etwa 2 Jahren und entwickeln einen langsam progredienten Phänotyp, der am ehesten der chronischen Verlaufsform der Erkrankung des Menschen entspricht. Die Expression des mutierten Proteins erfolgt vor allem im frontalen und temporalen Cortex, dem Hypocampus, den Basalganglien, insbesondere dem Striatum und dem Mesencephalon. Deutlich geringere Expression findet im Kleinhirn und im Rückenmark statt.

Die Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen im Tierstall des Instituts für Pharmakologie der Universitätsklinik Münster gehalten, unter der Leitung der zentralen tierexperimentellen Einrichtung (ZTE). Die Tierversuchsgenehmigungsnummer der Bezirksregierung Münster lautete G 54/2006.

 

Die Tiere wurden im Alter von jeweils 5, 10, 15 und 20 Monaten mit bildgebenden Verfahren untersucht. Dazu wurden die Tiere mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose betäubt. Zum Einsatz kamen die Magnetresonanztomographie sowie die Positronen-Emissionstomographie, um sowohl anatomisch substanzielle als auch Stoffwechselveränderungen im Verlauf der Erkrankung festzustellen. Genutzt wurden der Philips-Ganzkörper-MR-Scanner mit drei Tesla im Institut für klinische Radiologie des Universitätsklinikums Münster, ausgerüstet mit zwei hochauflösenden Vierelementoberflächenspulen, die speziell für die Untersuchung von Kleintieren konzipiert worden sind. Es wurden sowohl T1 als auch T2 gewichtete Messungen durchgeführt. Die Darstellung des Hirnstoffwechsels der tgHD-Ratten und der Kontrolltiere erfolgte nach Injektion von jeweils ca. 40 mBq F18-FDG über eine Schwanzvene im Tierquad-HIDAC-PET der Firma Oxford Positron Systems Ltd. in der Klinik für Nuklearmedizin in der Universität Münster. Die Datensätze von MRT und PET wurden fusioniert. Die ROIs (Regions of Interest), Striata und Kleinhirn sowie das gesamte Gehirn, wurden markiert und ausgewertet. Im Unterschied zu den F18-FDG-PET-Voruntersuchungen durch von Hörsten et al. 2003, die nur am Gesamthirn

 

 

vorgenommen worden waren, wurden jetzt spezifische Hirnregionen wie das Striatum untersucht und das Kleinhirn als nicht vom Krankheitsprozess betroffenes Areal als Referenzbereich bestimmt. Dadurch konnten in der vorliegenden Arbeit Störeinflüsse wie Muskelaktivität oder Veränderungen der Umgebungsbedingungen weitestgehend ausgeschlossen werden.

 

Die motorische Leistung der Tiere wurde jeweils im Alter von 15 und 21 Monaten in einem akzelerierten Rotarod, dem Accelerod der Feinmechanik-Werkstatt der Orthopädie des Universitätsklinikums Münster gemessen.

 

Die Erhebung und Auswertung der Daten erfolgte über einen Zeitraum von etwa zwei Jahren. Es handelte sich um eine explorative Studie. Von allen erhobenen Messwerten wurden Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. Alle durchgeführten Tests wurden auf einem Signifikanzniveau von 5% durchgeführt.

 

Obwohl eine maximale Ausprägung der pathologischen Veränderungen vor dem Versterben und damit zum vierten Messzeitpunkt angenommen werden konnte, ergaben die MRT-Messungen keine signifikante Abnahme der striatalen Volumina.

Auch mittels  FDG-PET-Bildgebung war die erwartete Neurodegeneration nicht darzustellen. Die Messung der mittleren und der maximalen striatalen Aktivität mit Bezug auf die Kleinhirnaktivität ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen transgenen Tieren und Kontrolltieren. Möglicherweise ist F18-FDG für die Untersuchung der transgenen Huntington-Ratten zu unspezifisch.

In der Accelerod-Untersuchung ließ sich in dieser Studie ebenfalls keine signifikant schlechtere Laufleistung der transgenen Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren erkennen.

Aufgrund der erhobenen Befunde steht die generelle Eignung des hier untersuchten transgenen Ratten-Modells für die Huntingtonsche Krankheit zur Disposition. In der mit einer großen Tierzahl unter standardisierten Bedingungen durchgeführten Studie konnte weder im Querschnitt noch im Verlauf mittels PET- und MRT-Messungen und Accelerod-Untersuchungen ein pathologischer Phänotyp detektiert werden. Es waren keine Hinweise auf neurodegenerative Veränderungen im Striatum transgener HD-Ratten in vivo nachweisbar. Zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, inwieweit sich die hier gefundenen Ergebnisse reproduzieren lassen und transgene Ratten mit einem anderen molekularen Aufbau einen mit dem Menschen vergleichbareren Phänotyp aufweisen.

 

abstract (englisch)

The hypothesis of the work presented was that transgenic Huntington rats develop neurodegeneration measurable in PET and MRI during the course of the disease or their life span. Should this hypothesis be confirmed, the rat model could be used for further treatment or follow-up studies.

 Huntington’s disease (HD) belongs to the growing group of inherited neurodegenerative CAG triplet-repeat disorders, which are based on a pathological extension of guanine cytosine-adenosine sequences. The mutant gene section of the HD gene is located within a sequence that encodes for the cytoplasmic protein huntingtin (htt). Probably caused by the pathological CAG extension htt develops unclarified toxic effects, which induce the symptoms of Huntington's disease, a principle known as "Game-of-function".

Huntington's disease is one of the most common genetic human disorders. It is characterized by the increasing loss of motor control and leads to uncontrollable hyperkinesia, dysdiadochokinesia as well as by decreasing intellectual skills and psychiatric symptoms such as personality changes, violence, delusions and depression. The disease, which typically manifests itself in adulthood, leads slowly progressive over a period of usually 15-20 years to the death of the patient. Characteristic pathological findings include atrophy in the area of the cerebral cortex and the basal ganglia, especially of the striatum. During the course of the disease, the entire brain loses up to 30% of weight.

The test animals were 35 Sprague-Dawley rats from the group of Professor Dr. Stephan von Hörsten, Erlangen. 17 homozygous transgenic animals were compared with 18 control  animals tested as not transgene. The Huntington's disease gene was randomly inserted into the genome of the transgenic rats. The animals produce the

disease-inducing pathological protein in addition to normal endogenous protein huntingtin. The tgHD rat model has the advantage of a chronic phenotype. TgHD rats have a life expectancy of more than 2 years as opposed to the previously used mice.

 

Hence this rodent model is phenotypically most closely comparable to the human chronic form of the disease, with respect to the life expectancy of rats. The expression of the mutated protein is in the frontal and temporal cortex, the hippocampus, the basal ganglia, particularly the striatum, and the midbrain. Significantly lower expression are found in the cerebellum and spinal cord.

The animals were kept under standardized conditions in the Institute of Pharmacology of the University Hospital of Münster, under the direction of the Central animal facility (ZTE). Ethical approval was obtained from the local authorities (Regierungsbezirk Münster, 54/2006 G)

 All animals were examined at the age of 5, 10, 15 and 20 months with imaging techniques. Prior to imaging, all animals recieved isoflurane inhalation anesthesia. Magnetic Resonance Imaging (3 Tesla MRI Scanner) and Positron Emission Tomography were used to determine substantial anatomic as well as metabolic changes. Imaging of brain metabolism of tgHD rats and control animals was carried out after injection of approximately 40 mBq F18-FDG through the tail vein in the animal-Quad-HIDAC PET of Oxford Positron Systems Ltd. at the Department for Nuclear Medicine at the University of Münster. The data sets of MRI and PET were merged. ROIs (regions of interest) encompassing striata, the entire brain and cerebellum were manually placed on the MRI and transferred to the co-registered μPET. Mean and maximal FDG-PET activities within ROIs were calculated and normalized to cerebellar FDG uptake. Activity and spatially normalized FDG-μPET were compared between groups on a hypothesis-free voxel-by-voxel basis using SPM. In contrast to the preliminary F18-FDG-PET investigations by Hörsten et al. 2003, which only examined  the entire brain, now specific brain regions were investigated and the cerebellum as a non-affected area was determined as reference area. By this, interfering factors like muscle activity or changes in ambient conditions could be almost excluded in the present work.

Motor performance of the animals was measured at the age of 15 and 21 months in an accelerated Rotarod, the Accelerod of the precision mechanics workshop of Orthopedics of the University Hospital of Münster.

 

The collection and analysis of data was carried out over a period of about two years.

 

Averages and standard deviations of the collected measures were calculated. All tests were conducted at a significance level of 5%. The exact two-sided significance was determined.

However MRI measurements showed no significant decrease of striatal volumes, although a maximum expression of pathological changes before the death and thus the fourth time of the measurement can be assumed.

Further, Neurodegeneration was not represent by means of FDG-PET imaging. Measurement of the middle and the maximum striatal activity with relation to the cerebellum activity showed no significant difference between transgenic and control animals. F18-FDG may be too unspecific for the investigation of the Huntington transgenic rats.

Also the Accelerod investigation revealed no significantly worse mileage of transgenic animals as compared to the control animals.

Based on findings presented here the general suitability of the tested transgenic rat model for Huntington disease is debatable. In the study carried out with a large number of animals under standardized conditions, no pathological phenotype could be detected in the cross section, nor in the course of using PET and MRI measurements and Accelerod studies. Future studies must show to what extent the results found here may be reproduced and if transgenic rats with a different molecular structure exhibit a phenotype comparable with the humans.

 

keywords

Huntington´s disease, rat, imaging, Huntington’sche Krankheit, Ratte, Bildgebung

kb

1.284