Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sabrina Lilienthal

Veränderungen der Proteinsekundärstruktur in Eigelb, Eigelbfraktionen und Eiklar von Hühnereiern während der frühen Brutphase

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105739

title (engl.)

Changes in the protein secondary structure of hen’s egg yolk, egg yolk fractions and albumen during early incubation

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/lilienthals_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Das Ei ist eine abgeschlossene Zelle außerhalb des maternalen Organismus, aus der sich ohne die Zugabe anderer Stoffe von außen, nur durch Wärme, Gasaustausch und gelegentliche Rotationen ein vollständig neues Lebewesen, das Küken, entwickelt. Folglich müssen im Verlauf der Bebrütung qualitative und quantitative Veränderungen im Eigelb, seinen Fraktionen, den individuellen Proteinen und dem Eiklar stattfinden, um dieses neue Lebewesen zu erschaffen. Obwohl bereits viele biologische und chemische Mechanismen, die während der Bebrütung ablaufen, aufgeklärt werden konnten, ist bis heute wenig über Proteinveränderungen des verbleibenden Eigelbs auf molekularer Ebene während der frühen Phase der embryonalen Entwicklung bekannt.

Ziel dieser Arbeit war es, erstmalig die bebrütungsinduzierten Veränderungen der Sekundärstruktur von Eigelb, seinen drei Hauptfraktionen (Granula, Plasma, LDL), den assoziierten Proteinen und Eiklar während der frühen Phase der aviären Embryonalentwicklung zu untersuchen. In diesem Zusammenhang sollte betont werden, dass sich diese Arbeit mit den Veränderungen der Proteine auf molekularer Ebene befasst und nicht mit der Embryogenese an sich.

Die Überprüfung der mutmaßlich auftretenden Proteinveränderungen fand mittels einer Kombination aus FTIR-Technik, konventioneller IEF-Methode und HPLC-Messungen statt. Diesbezüglich wurden zwei Faktoren ausgewertet, die potentiell mit Veränderungen der Proteinsekundärstruktur von Eigelb verknüpft sein könnten. Zuerst wurde der Eigelb pH-Wert von Bruteiern während einer acht tägigen Inkubationszeit bestimmt und mit dem Eigelb pH-Wert von Nativeiern verglichen, die gleichermaßen bebrütet wurden. Im Anschluss wurde ein möglicher Effekt der Eisenfreisetzung aus Phosvitin, einem wichtigen Eigelbprotein, untersucht. Phosvitin wird in diesem Zusammenhang eine bedeutende Rolle während der Hämatopoese des sich entwickelnden Kükens als Eisenträger (Fe3+) des Eigelbs zugeschrieben. Im Folgenden wurden Eigelb, seine Hauptfraktionen und Eiklar im Verlauf der frühen Bebrütung mittels FTIR-Messungen analysiert. Zur begleitenden Bestätigung der FTIR-Ergebnisse wurden die bebrüteten Eigelbproben mittels IEF-Technik untersucht sowie die FTIR-Ergebnisse der bebrüteten Eiklarproben mittels HPLC-Messungen überprüft. Die Auswertung der pH-Wertmessungen sowie die Eisenfreisetzung aus Phosvitin ergaben, dass weder der signifikante Anstieg des Eigelb-pH-Wertes der Bruteier (von 6,07 auf 6,92), noch die signifikante Eisenfreisetzung aus Phosvitin (von 1,98 ± 0,06 µg/mg auf 0,11 ± 0,03 µg/mg) direkt mit den Veränderungen der Proteinsekundärstruktur von Eigelb und seinen Fraktionen in Verbindung gebracht werden können. Die FTIR-Messungen zeigten, dass die Proteinkonformationen der Voll-Eigelbproben, der Granula- und LDL-Fraktion sowie der Eiklarproben im Verlauf der Bebrütung stabil blieben. Demgegenüber offenbarte die separate Untersuchung der Plasmafraktion signifikante Veränderungen der Proteinsekundärstruktur an Tag 3 und Tag 4 der Bebrütung (p ≤ 0,0001) gegenüber den übrigen Bruttagen (Tag 0, 5 und 8). Es wird jedoch als unwahrscheinlich erachtet, dass diese Veränderungen durch Sekundärstrukturänderungen der ursprünglich im Plasma vorkommenden Proteine hervorgerufen wurden. Vielmehr wird dem physiologischen Influx von Eiklar in den Dottersack im Verlauf der Bebrütung eine wichtige Rolle bei der Proteinmodifikation von Eigelb zugeschrieben. Diese Modifikationen, die mittels FTIR-Messungen ermittelt werden konnten, wurden darüber hinaus durch IEF-Untersuchungen der wasserlöslichen Eigelbproteine, sowie ausgewählter Eiklarproteine (Ovalbumin, Ovotransferrin, Lysozym) bestätigt. Dabei konnten keine zusätzlichen Proteinbanden im Brutverlauf detektiert werden, die auf die Entstehung neuer Proteine hinwiesen. Als unterstützende Methode zeigten die HPLC-Messungen der Eiklarproben der Bruteier in Übereinstimmung mit den IEF-Ergebnissen, dass im Verlauf der Bebrütung keine neuen Peaks in den Chromatogrammen auftauchten. Die Eiklarproteine Ovalbumin, Ovotransferrin und Lysozym veränderten sich lediglich hinsichtlich ihrer Gehalte.

Um erstmalig ein lückenloses Bild über die Proteinsekundärstruktur von Eigelb liefern zu können, wurden die natürlich vorkommenden Anteile (%) der Sekundärstrukturelemente von Eigelb und seinen drei Fraktionen an Tag 0 der Bebrütung erstmals mittels der FTIR-Technik bestimmt. Anhand dieser Messungen konnte gezeigt werden, dass sich die Granulafraktion hauptsächlich aus einer Mischung von inter- und intramolekularen β-Faltblattstrukturen (57,0 % ± 0,4 %) zusammensetzt, geringeren Anteilen von α-helikalen/ungeordneten Strukturen sowie β-Schleifen und β-Faltblättern im höheren Wellenzahlenbereich des Spektrums. Die Plasmafraktion besteht vornehmlich aus α-Helices (43,2 % ± 0,3 %) sowie ähnlich großen Anteilen an intermolekularen β-Faltblattstrukturen und β-Schleifen. Demgegenüber ist die LDL-Fraktion beinahe ausschließlich aus intramolekularen β-Faltblattstrukturen zusammengesetzt (67,4 % ± 0,6 %). Obwohl sie einen Großteil der Plasmafraktion ausmacht (85-90 %), weist sie keinerlei α-helikale Anteile auf. Die Eigelbproben hingegen zeichneten sich hauptsächlich durch intermolekulare β-Faltblattstrukturen aus (39,8 % ± 0,5 %), was vermutlich durch molekulare Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Eigelbfraktionen bedingt ist. Des Weiteren wurden in diesen Proben noch α-helikale/ungeordnete Strukturen sowie β-Schleifen vorgefunden.

Im Zuge dieser Untersuchungen konnte erstmalig gezeigt werden, dass sich die Proteinsekundärstruktur der LDL-Fraktion im unbehandelten (nicht-gefriergetrockneten) Zustand deutlich von der Struktur des gefriergetrockneten, rekonstituierten Zustands unterscheidet. Während die unbehandelten LDL-Proben vornehmlich intramolekulare β-Faltblattstrukturen aufweisen, sind diese in den behandelten LDL-Proben zugunsten von α-helikalen Anteilen beinahe vollständig verschwunden. Die LDL-Proben durchlaufen dabei unterschiedliche Zwischenstufen vom unbehandelten zum gefriergetrockneten Stadium, welche sich in intermediären Spektrenformen der Ausgangs-und Endspektren äußern. Der Grund für die beschriebene Konformationsänderung der LDL-Proben zwischen den verschiedenen Bearbeitungsstadien, konnte bisher nicht vollständig aufgeklärt werden. Anhand der erzielten Ergebnisse wird allerdings vermutet, dass die Konformationsänderungen mit der auftretenden Gelbildung in Eigelb während des Gefrier- und Auftauprozesses in Verbindung zu bringen sein könnten. Hinweise darauf geben die auffälligen Sekundärstrukturänderungen der LDL-Fraktion vom nativen hin zum gefriergetrockneten, rekonstituierten Zustand der Proben. In diesem Zusammenhang wäre es außerdem von Interesse zu überprüfen, ob die eventuell verbliebenen wasserlöslichen Proteine des Plasmas (Livetine) während der voranschreitenden Strukturänderungen, die durch die Gefriertrocknung bedingt sind, eine Rolle durch einen molekularen Austausch mit den Proteinen von LDL spielen.

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche konnten zeigen, dass der Einsatz von FTIR-Messungen ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Sekundärstrukturveränderungen von komplexen Proteinzusammensetzungen ist. Des Weiteren konnte die IEF-Technik als eine aussagekräftige Begleitmethode zur Unterstützung der mittels FTIR-Messungen erzielten Ergebnisse identifiziert werden. Die erzielten Ergebnisse liefern erstmalig ein lückenloses Bild über die Sekundärstruktur von Eigelb, seine drei Hauptfraktionen sowie Eiklar. Zudem geben sie erstmalig einen wichtigen Einblick in die Veränderungen der Eigelb- und Eiklarproteine bebrüteter Eier während der frühen Embryogenese. Sie tragen somit zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen von Proteinmodifikationen im Embryo-Entwicklungsprozess bei.

abstract (englisch)

An avian egg is an enclosed cell, which matures outside of the maternal organism. Without the addition of external substances, protected only by a hard shell and supported by the needed exchange of gases, thermal energy, and occasional turns, a new animal, the chick, develops. In the course of incubation, both qualitative and quantitative changes must take place in the yolk, its major fractions, the individual proteins, and albumen in order to create this new life. Although many biological and chemical mechanisms proceeding during incubation have been elucidated, the early phase of embryonic development is still poorly understood in regard to protein changes on a molecular level in the remaining egg yolk.

The aim of the present study was to evaluate for the first time the ongoing incubation-induced changes in egg yolk, its three major fractions, the associated proteins and albumen during the early phase of avian embryonic development. In this context it should be emphasized that this study was concerned with protein changes on a molecular level rather than with embryogenesis itself.

The incubation-induced alterations in the protein secondary structures of egg yolk and its major fractions (granules, plasma, and LDL) were monitored using the FTIR-technique, the IEF-method and HPLC-measurements. In this regard, two factors potentially connected with egg yolk protein secondary structure changes were evaluated. Firstly, the pH value of incubated egg yolk from fertilized eggs was determined during eight-day incubation and compared to the pH value of incubated egg yolk from non-fertilized eggs, which were incubated identically. Secondly, the effect of an iron-release from phosvitin, an important egg yolk protein, which is assumed to play a considerable role in hematopoiesis during early embryogenesis as the iron (Fe3+) carrier of egg yolk, was explored. Subsequently egg yolk, its major fractions and albumen were examined via FTIR measurements. Confirming the FTIR results, the incubated egg yolk samples were analyzed by IEF and the results of the albumen samples were surveyed by HPLC. However, neither the significant increase in pH value (6.07 to 6.92) of egg yolk during incubation of fertilized eggs, nor the significant release of iron from phosvitin (1.98 ± 0.06 µg/mg to 0.11 ± 0.03 µg/mg) were found to be directly related to the changes in protein secondary structure in egg yolk and its fractions. FTIR showed that the protein conformation in whole egg yolk, granules, LDL and albumen was stable during incubation, but separate evaluation of the plasma fraction revealed significant changes in secondary structure on days 3 and 4 of incubation. However, it is unlikely that these changes were provoked by structure changes of the proteins originally present in plasma. Instead, the physiological influx of albumen into the yolk sac was expected to play an important role in the protein modifications of egg yolk. These modifications, as was shown by FTIR, could be confirmed by IEF of the water-soluble egg yolk proteins and selected albumen proteins (ovalbumin, ovotransferrin, and lysozyme). No extra bands were identified during incubation to indicate the emergence of new proteins. Supportingly, the HPLC measurements of the albumen samples showed no emergence of new peaks in the chromatograms in the course of incubation. The albumen proteins ovalbumin, ovotransferrin, and lysozyme only modified with respect to their contents in the samples.

To provide a complete picture of the protein secondary structure of egg yolk for the first time, FTIR was used to determine the naturally occurring proportions (%) of the secondary structure elements in egg yolk and its three fractions on day 0 of incubation. The granules fraction mainly consisted of a mixture of inter- and intramolecular β-sheets (57.0% ± 0.4%), lower proportions of α-helical/unordered structures as well as β-turns and β-sheets in the range of higher wavenumbers. The plasma fraction was found to consist mainly of α-helices (43.2% ± 0.3%), as well as similarly portions of intermolecular β-sheets and β-turns. In contrast, the LDL fraction was composed almost exclusively of intramolecular β-sheets (67.4% ± 0.6%). Although this fraction accounts for the better part of the plasma fraction (85-90%), it did not show any α-helical portions. On the other hand, whole egg yolk was mainly composed of intermolecular β-sheets (39.8% ± 0.5%), potentially indicating molecular interchanges between the individual fractions. Furthermore, α-helical/unordered structures as well as β-turns could be detected in these samples.

In the course of this study, it could be shown for the first time that the protein secondary structure of native LDL markedly differed from the structure, which was found in the freeze-dried, reconstituted LDL samples. While the native LDL samples were primarily composed of intramolecular β-sheet structures, these shares disappeared almost completely in favor of α-helical structures in the treated LDL samples. In the meantime, the samples pass through different stages, which manifest themselves in intermediate shapes of the native and freeze-dried LDL spectra. However, the reason for the conformational changes of the LDL samples during the thermal treatment has not yet been fully elucidated. Based on the results obtained, it is assumed that the changes could be related to the gel formation occurring in egg yolk during freezing and thawing. This is indicated by the striking changes in the secondary structure from the native LDL samples towards the freeze-dried, reconstituted state of the samples. In this context it would be of further interest to examine, whether the eventually remaining water-soluble proteins of the egg yolk plasma fraction also play a role, by a molecular exchange with the proteins of LDL, during the preceding structural changes caused by the freeze-drying process.

In the present study it could be shown that FTIR measurement is a useful tool for examining alterations in the secondary structure of complex protein compositions. Furthermore, the IEF technique was considered as a meaningful concomitant method to support the results obtained by FTIR measurements. The findings provide, for the first time, a complete picture of the protein secondary structure of egg yolk, its three major fraction and albumen. Furthermore the results give insight into the changes in egg yolk and albumen proteins of fertilized eggs during embryogenesis and provide better understanding of the molecular mechanisms of protein modification in the embryo development process.

keywords

FTIR, Proteinsekundärstruktur, Bruteier; FTIR, protein secondary structure, incubated eggs

kb

5.606