Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Lisa Lenz

Charakterisierung des bovinen plazentaren Insulin-like growth factor systems in vitro und der peripartalen Expression von IRS1 und IRS2 im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes in vivo

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107056

title (engl.)

Characterization of the bovine placental insulin-like growth factor system in vitro and the peripartal expression of IRS1 and IRS2 in the placentome and interplacentomal tissue of dairy cows in vivo

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/lenzl_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Postpartale Erkrankungen des Uterus spielen bei den heutigen Hochleistungs- Milchkühen eine große Rolle, da sie zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führen. Hierbei wird eine Beteiligung des IGF-Systems vermutet, da veränderte IGF Serumspiegel mit negativer Energie-Balance und einem erhöhten Risiko von einer puerperalen Erkrankung betroffen zu sein vergesellschaftet sind (Wathes et al., 2009; Piechotta et al., 2012). Nach der Lokalisation von Mitgliedern des IGF-Systems im Reproduktionstrakt des Rindes (Robinson et al., 2000; Richterich, 2008; Lütkehus, 2012) ist das Ziel der vorliegenden Studie, die der IGF Signalgebung zugrundeliegenden Mechanismen auf in vitro Ebene zu erforschen. Hierfür wurden bovine plazentäre Zelllinien (BCEC, F3, Fibroblasten) mit IGF1 und IGF2 alleine, beziehungsweise in Kombination mit EGF stimuliert und die Wirkungen auf die Zellproliferation und Motilität untersucht. Die intrazelluläre Signalvermittlung wurde mittels Western Blot über die Aktivierung der MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase und p38 MAP Kinase analysiert. Da nach Aktivierung des IGF1R die Adaptorproteine IRS1 und IRS2 für die Signalvermittlung in der Zelle entscheidend sind, wurden diese im Plazentom und in interplazentomaren Bereichen des Rindes mittels Immunhistochemie lokalisiert. Das Material wurde am 275. Tag der Trächtigkeit während einer Sectio caesarea oder nach spontan erfolgter Geburt, normalem Abgang der Nachgeburt und Instillation von LPS Lösung in den Uterus mit anschließender Euthanasie entnommen. Beide Gruppen wurden zusätzlich anhand ihrer IGF1-Blutspiegel noch in IGF-high und IGF-low Tiere eingeteilt. In Vitro kam es bei den BCEC, F3 Zellen und Fibroblasten nach Stimulation mit IGF1 und IGF1+EGF zu einer signifikant höheren Steigerung der Proliferation. IGF2 vermochte die Proliferation von F3 Zellen und Fibroblasten signifikant zu steigern. Die Kombination von IGF2+EGF führte bei den untersuchten Zelllinien ebenfalls zu einer signifikant höheren Proliferation, während EGF ausschließlich die Proliferation von F3 Zellen signifikant steigern konnte. Hervorzuheben ist, dass die Kombination von IGF2 +EGF bei den BCEC diese signifikante Steigerung erreichen konnte, obwohl die Stoffe einzeln nicht dazu in der Lage waren. Bei den F3 Zellen hingegen war eine antagonistische Wirkung festzustellen. IGF2+EGF verursachten eine signifikant schwächere Proliferation im Vergleich mit EGF, wenn auch signifikant höher als die Wachstumskontrolle. Bei den BCEC wurde mit jeder Stimulation eine signifikante Steigerung der Motilität erreicht. IGF1 und IGF2+EGF verursachten eine signifikante Steigerung bei den F3 Zellen und den Fibroblasten, ebenso wie IGF1+EGF bei den F3 Zellen und IGF2 bei den Fibroblasten. Bei den F3 Zellen kam es durch Kombination von IGF2 und EGF zu einem synergistischen Effekt, die Motilität war signifikant höher als nach Stimulation mit den einzelnen Wachstumsfaktoren. Bei den Fibroblasten kam es hingegen durch das Zusammenwirken von IGF1+EGF zu einem antagonistischen Effekt. Die Untersuchung der intrazellulären Signalwege brachte folgende Ergebnisse: bei den F3 Zellen wurden die MAP-Kinase 42/44 und die Akt Kinase durch alle eingesetzten Stimulantien aktiviert. Die p38 MAPKinase erfuhr durch Stimulation mit IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF eine Aktivierung. Bei den Fibroblasten kam es durch jede Stimulation zu einer Aktivierung aller untersuchten Kinasen. Die MAP-Kinase 42/44 und die p38 MAP Kinase wurden bei den BCEC durch IGF1+EGF, EGF und IGF2+EGF aktiviert, die Akt Kinase durch EGF. Es ist erkennbar, dass bei den F3 Zellen und den BCEC die Wirkung von EGF überwiegt. Im Folgenden werden die immunhistochemischen Färbungen der Plazentome betrachtet. Die Orte der stärksten Expression waren für sowohl IRS1 als auch IRS2 die mononukleären Trophoblasten. IRS2 wurde in gleichem Maße auch im fetalen Mesenchym exprimiert. Auf maternaler Seite waren nur schwache bis negative Expression auszumachen, bis auf die Arterien, welche positiv angefärbt waren. In den interplazentomaren Proben wurde eine deutliche Expression von IRS1 und IRS2 in den uterinen Drüsen festgestellt. Das luminale Epithel wies eine von negativ bis positiv ausfallende Expression beider Adaptormoleküle auf. Auffällig war eine sehr starke Anfärbung der darauf sitzenden apikalen Membran bei IRS1. Auch die Arterien waren wieder positiv, im Gegensatz zu den Venen. Die Immunzellen zeigten für beide Antikörper sowohl im Plazentom, als auch im interplazentomaren Bereich eine variable Anfärbung. Die Ergebnisse lassen auf zellspezifische Aufgaben der beiden Adaptormoleküle IRS1 und IRS2 in den peripartalen Umbauvorgängen im Uterus schließen. Insgesamt betrachtet lassen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss zu, dass IGF1 und IGF2 während der Trächtigkeit des Rindes für Proliferation und Motilität im Plazentom entscheidend sind und in Wechselwirkung mit EGF stehen. Für diese Vorgänge werden in vitro je nach Zelltyp, in unterschiedlicher Ausprägung, die Signalwege von MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase und p38 MAP Kinase genutzt. Die Expression von IRS1 und IRS2 in Plazentom und interkarunkulären Bereichen des Rindes lassen eine Beteiligung an der Vermittlung intrazellulärer Signale nach IGF Stimulation vermuten. Aufgrund dieser Erkenntnisse bieten sich verschiedene Angriffspunkte für eine Modulation zur Bekämpfung puerperaler Erkrankungen, aber auch mögliche Marker für die Diagnostik. Hierfür müssten weiterführende Untersuchungen vorgenommen werden.

abstract (englisch)

Postpartal uterine dieseases are one of the major problems in the dairy cow herd management today, because they provoke severe economical losses. In this regard, the IGF-system might play a significant role as there is evidence that negative energy balance and deviating IGF level are associated with puerperal diseases in dairy cows (Wathes et al., 2009; Piechotta et al., 2012). After the localization of the members of the IGF-system in the uterus and placentome of cattle (Robinson et al., 2000; Richterich, 2008; Lütkehus, 2012), the goal of this study was to elucidate the underlying mechanisms of the IGF-system in vitro. Three bovine, placental cell lines (BCEC, F3, fibroblasts) were stimulated with IGF1 and IGF2 alone or in combination with EGF, and the influence on proliferation and motility was examined. The intracellular signaling after stimulation was analysed by western blots for the activation of MAP Kinase 42/44, Akt-Kinase, and p38 MAP Kinase. Since the adaptorproteins IRS1 and IRS2 are crucial for downstream signaling after IGF1R activation their expression was examined in the bovine placentome and in interplacentomal areas by immunohistochemistry. The material was taken on day 275 of gestation during a caesarian section or after spontaneous labour. After release of fetal membranes, LPS-instillation and euthanization were conducted. Both groups were further subgrouped into IGF-low and IGF-high animals, according to their blood IGF-levels. In vitro a significant increase of proliferation after stimulation with IGF1 and IGF1+EGF was seen in BCEC, F3 cells and fibroblasts. On the contrary, IGF2 was capable of significantly increasing the proliferation of F3 cells and fibroblasts. The combination of IGF2+EGF was again able to enhance the proliferation of all three analyzed cell lines, whereas EGF only enhanced the proliferation of F3 cells. It has to be emphasized that the combination of IGF2+EGF was able to increase the proliferation significantly, while the two growth factors on their own failed to do so. Regarding F3 cells, a contrary result was obtained: IGF2+EGF seemed to have an antagonistic effect. Their combination resulted in a significantly lower proliferation compared to EGF, although a significant increase related to the cells grown in serumfree medium was observed. In BCEC, a significant enhancement of motility was found after each stimulation. IGF1 and IGF2+EGF led to a significant increase of the motility of F3 cells and fibroblasts, just as IGF1+EGF in F3 cells and IGF2 in fibroblasts. The combination of IGF2 and EGF had a synergistic effect on F3 cells; the motility was significantly higher compared to the single stimulations. Considering fibroblasts an antagonistic effect was noticeable after stimulation with IGF1+EGF. The results of the investigation regarding the intracellular signal cascades were as follows: the MAP-Kinase 42/44 and the Akt Kinase of F3 cells was activated by all analyzed growth factors. The p38 MAPK Kinase was activated by IGF1+EGF, EGF, and IGF2+EGF. Regarding the fibroblasts, an activation of the examined kinases was seen after every stimulation. MAP-Kinase 42/44 and p38 MAP Kinase were activated by IGF1+EGF, EGF, and IGF2+EGF in BCEC, whereas the Akt Kinase was only activated by EGF. Thus it appears that the impact of EGF exceeded that of the other two growth factors in F3 cells and BCEC. In the immunohistochemical stainings of the placentomes it is obvious that IRS1 and IRS2 are mainly located in the mononuclear trophoblasts. IRS2 is as prominent in the fetal mesenchyme. Concerning the maternal part, there was a variation from a weak to no expression, except for the arteries, which were positive. In the interplacentomal samples IRS1 and IRS2 were located in the uterine glands. In the luminal epithelium the staining of both adaptor proteins varied from negative to positive. Remarkable was the intense staining of the apical membrane for IRS1. Again, only the arteries, but not the venes were positive. The intense of staining of immune cells was variable in interplacentomal areas and in the placentome and for both antibodies. In conclusion, there seem to be cell-specific functions of both adaptorproteins IRS1 and IRS2 in the ongoing remodeling processes during the peripartal time. In summary, the results of this work led to the conclusion that IGF1 and IGF2 during gestation are crucial for proliferation and motility in the bovine placentome and interact with EGF. Depending on the cell type, these processes in vitro are differentially regulated by MAP-Kinase 42/44, Akt Kinase, and p38 MAP Kinase. The expression of IRS1 and IRS2 in the placentome and intercaruncular tissue led to the assumption that they take part in the intracellular signaling after IGF stimulation. Based on these findings, new various targets for modulation as well as some potential novel markers for diagnostics could be developed to combat puerperal diseases. However, further investigations are needed.

keywords

bovine Plazenta, IGF, IRS, bovine placenta, IGF, IRS 

kb

7.544