Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Annika Lehmbecker

Charakterisierung potentiell regenerationsfördernder Gliazellen sowie ihre Interaktion mit Spinalganglienneuronen von adulten Hunden

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111396

title (eng.)

Characterization of potentially pro-regenerative glial cells and their interaction with dorsal root ganglion neurons of adult dogs

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/lehmbeckera_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Diese Arbeit untergliedert sich in drei Teile. Im ersten Teil wurden verschiedene Gliazellen des Hundes in vitro vergleichend untersucht. Der zweite Teil befasste sich mit der Isolation und Aufreinigung von Schwann-Zellen für eine mögliche autologe Transplantation. Und im dritten Teil wurden Satellitenzellen des Hundes in vivo und in vitro charakterisiert und hinsichtlich ihrer regenerationsfördernden Eigenschaften untersucht. Schwann-Zellen, olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zell-ähnliche Gliazellen werden als vielversprechende Kandidaten für Zelltransplantationsstudien in der Therapie von Rückenmarksschäden eingesetzt. Ihre Gemeinsamkeiten und Unterschiede in vitro auf Transkriptom- und Proteinebene wurden näher charaktersisiert. Olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zell-ähnliche Gliazellen besitzen keine transkriptionellen Unterschiede in den durchgeführten Untersuchungen. Zudem zeigten olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zell-ähnliche Gliazellen eine große Ähnlichkeit zu Schwann-Zellen. Alle drei Zelltypen wiesen hingegen große transkriptionelle Unterschiede zu den vergleichend untersuchten Fibroblasten auf. Olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zell-ähnliche Gliazellen wiesen eine Aufregulation von contactin associated protein-like 2 und epidermal growth factor containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 auf. Zudem wurden Aquaporin 1 (AQP1) und stimulator of chondrogenesis 1 (SCRG1) als vielversprechende Marker zur Unterscheidung von Schwann-Zellen von olfaktorischen Hüllzellen und Schwann-Zell-ähnlichen Gliazellen identifiziert. Auf Proteinebne konnte dies anhand unterschiedlicher Expression von AQP1 und SCRG1 bestätigt werden, so dass es sich bei olfaktorischen Hüllzellen und Schwann-Zell-ähnlichen Gliazelllen um transkriptionell und auch auf Proteinebene um einheitliche Zelltypen handelt, die zudem eine große Übereinstimmung zu Schwann-Zellen zeigen.

Darüber hinaus sollte die praktikable Umsetzung der Zellisolierung und Aufreinigung zur autologen Zelltransplantation von Schwann-Zellen bei Hunden mit spontan auftretenden Bandscheibenvorfällen untersucht werden. Dabei sollte das zur Schwann-Zell-Gewinnung benötigte Gewebe, in diesem Fall eine Biopsie der Dorsalwurzel zwischen Rückenmark und Dorsalwurzelganglion, bei der therapeutisch notwendigen chirurgischen Versorgung entnommen werden und in möglichst kurzer Zeit eine adäquate Zellzahl an aufgereinigten Schwann-Zellen gewonnen werden. Zudem wurden die Resultate der Charakterisierung dieser gewonnenen Schwann-Zellen mit Schwann-Zellen von Hunden ohne Bandscheibenvorfälle verglichen, um etwaige negative Einflüsse aufgrund des pathologischen Milieus auszuschließen. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb von 26 (±4) Tagen eine ausreichende Anzahl an p75 Neurotrophin-Rezeptor exprimierenden Zellen mit einer Reinheit von 90,2 % (± 8,8) gewonnen werden konnten. Allerdings fand sich ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Zellzahl zwischen Zellen, die von Hunden mit akutem/subakutem Bandscheibenvorfall stammten, zu Hunden bei denen ein chronischer Bandscheibenvorfall vorlag (akut/subakut: 6,82 ± 6,36 x106 Zellen; chronisch: 2,29 ± 2,00 x 106 Zellen). Hinsichtlich des Kultivierungszeitraums und der Kulturreinheit waren keine Unterschiede erkennbar. Trotz der sehr kleinen Probengröße des Ausgangsgewebes und des veränderten Milieus aus dem die Nervenbiospie entnommen wurde, konnten erfolgreich Schwann-Zellen in ausreichender Menge isoliert werden. Auch wurde im Vergleich zu Schwann-Zellen, die von Hunden ohne bestehenden Bandscheibenvorfall isoliert wurden, kein negativer Einfluss des veränderten Milieus im Bereich des Bandscheibenvorfalls beobachtet. Die Funktionalität der isolierten Schwann-Zellen wurde anhand der Förderung des Neuritenwachstums in Ko-Kulturen mit Neuronen aus den Dorsalwurzelganglien adulter, gesunder Hunde untersucht. Dabei zeigte sich ein signifikant höheres Maß an auswachsenden und sich verzweigenden Neuronen in Anwesenheit der isolierten Schwann-Zellen. So dass mittels des etablierten Protokolls innerhalb von etwa drei Wochen eine ausreichende Anzahl an Schwann-Zellen für eine mögliche autologe Zelltransplantation isoliert und aufgereinigt werden können.

Als weitere mögliche Kandidaten für Zelltransplantationsstudien nach Bandscheibenvorfällen sollten die, in den Dorsalganglien lokalisierten, Satellitenzellen adulter Hunde morphologisch und funktionell charakterisiert werden. Hierbei wurde besonderes Augenmerk auf bestehende, Spezies-spezifische Unterschiede gelegt. In situ zeigte sich bei kaninen Satellitenzellen eine prominente Expression der Marker Nestin und Sox2. Kanine Satellitenzellen und auch die Satellitenzellen von nicht-humanen Primaten wiesen eine deutliche Expression von saurem Gliafaserprotein (GFAP) und 2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) auf. Dies stand im Gegensatz zu den untersuchten murinen Satellitenzellen. Diese exprimierten hingegen zu einem hohen Prozentsatz Glutamin-Synthetase ähnlich den Satellitenzellen von nicht-humanen Primaten. Wohingegen die Satellitenzellen des Hundes deutlich geringere Expressionen von Glutamin-Synthetase aufwiesen.

In vitro konnte gezeigt werden, dass sowohl kanine als auch murine Satellitenzellen zu einem großen Anteil CNPase exprimieren. Die Expression von GFAP war bei beiden Spezies abhängig von den unterschiedlichen Kulturbedingungen. Allerdings wurde bei beiden Spezies eine erhöhte Expression von GFAP durch die Zugabe von knochenmorphogenetischem Protein 4 erreicht. Zudem wurde gezeigt, dass kanine Satellitenzellen sich in Ko-Kultur positiv auf das Wachstum von Neuriten in isolierten Dorsalwurzelganglienneuronen auswirken. Zusammengefasst könnten die gewonnenen Erkenntnisse daraus hinweisen, dass Satellitenzellen Eigenschaften von Astrozyten und Oligodendrozyten vereinen und einen intermediären Gliazelltyp darstellen, der möglicherweise vielversprechende regenerative Eigenschaften kombiniert, die in zukünftigen Studien hinsichtlich ihrer Eignung für Zelltransplantationsstudien Berücksichtigung finden sollten.

abstract (englisch)

The present thesis is divided into three parts. Firstly, different canine glial cells were phenotypically investigated and compared in vitro. In the second part a protocol was established for the isolation and purification of canine Schwann cells derived from the dorsal spinal nerve root obtained during decompressing surgery from dogs suffering from intervertebral disk disease for autologous cell transplantation. The isolated Schwann cells were phenotypically and functionally characterized in vitro and in vivo. In the third part satellite glial cells derived from dorsal root ganglia were characterized in vitro and in vivo with respect to their possible pro-regenerative properties.

Schwann cells, olfactory ensheating cells, and Schwann cell-like brain glial are widely used as promising candidates in cell transplantation studies in spinal cord injury. The respective glial cell types were characterized with special emphasis on similarities and differences in their proteome and transcriptome. Olfactory ensheating cells and Schwann cells revealed no significant transcriptional differences in the present study. Furthermore, olfactory ensheating cells and Schwann cell-like brain glia showed many similarities with Schwann cells. In comparison to investigated fibroblasts all three glial cell types revealed striking differences within their transcriptome. Olfactory ensheating cells and Schwann cell-like brain glial showed an upregulation of contactin associated protein-like 2 and epidermal growth factor containing fibulin-like extracellular matrix protein 1. Additionally, aquaporin 1 (AQP1) und stimulator of chondrogenesis 1 (SCRG1) were identified as promising markers to differentiate peripheral Schwann cells from olfactory ensheating cells and Schwann cell-like brain glia. This was confirmed on protein level shown by differences in the expression of AQP1 and SCRG1. These investigations lead to the conclusion that olfactory ensheating cells and Schwann cell-like brain glial share many similarities with respect to protein and transcriptome level. These central glial cells also share many similarities with the peripheral Schwann cells.

In addition, the isolation and purification of Schwann cells derived from the dorsal root within a reasonable time frame for autologous cell transplantation in dogs suffering from intervertebral disc disease was investigated. The tissue necessary for Schwann cell isolation should be obtained during routine decompressive surgery and the isolation and purification should be performed within a short time period to achieve a sufficient number of purified Schwann cells. Furthermore, the expression profile of the isolated Schwann cells was compared to Schwann cells isolated from dogs without intervertebral disc disease to exclude potential negative effects caused by the pathologic milieu caused by the spinal cord compression. Within a time period of 26 (±4) days a sufficient number of p75 low affinity neurotrophin receptor expressing cells with a purity of 90.2 % (± 8.8) was achieved. Differences were observed with respect to cell yield between dogs suffering from acute/subacute spinal cord injury to chronically affected dogs (acute/subacute: 6.82 ± 6.36 x106 cells; chronic: 2.29 ± 2.00 x 106 cells). No differences were observed in the cultivation time between acute/subacute and chronically affected dogs. Despite the very small sample size used for cell isolation and the pathologically altered area the tissue was taken from, a sufficient number of Schwann cells could be isolated with the established protocol. A negative influence caused by the pathologically changed environment was excluded by comparing Schwann cells isolated from dogs with spinal cord injury to Schwann cells isolated from dogs without spinal cord injury. No significances were detected. With respect to functionality of the isolated Schwann cells, Schwann cells were co-cultivated with canine neurons isolated from dorsal root ganglia and the number of neurite outgrowth was measured. A significantly increased neurite outgrowth and neurite branching was observed in the presence of the isolated Schwann cells. The established protocol enables the isolation and purification of a suitable number of Schwann cells for potential autologous cell transplantation.

In addition, satellite glial cells isolated from dorsal root ganglia were morphologically and functionally characterized to elucidate their suitability for further cell transplantation strategies after spinal cord injury. The investigations focused on species specific differences between dogs and mice. In vivo canine satellite glial cells show a strong expression of nestin and Sox2. Canine and simian satellite glial cells also showed a prominent expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and 2',3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase). This was in contrast to the simultaneously investigated murine satellite glial cells which sowed a dominant expression of glutamine synthetase similar to simian satellite glial cells and unlike canine satellite glial cells. In vitro, canine and murine satellite glial cells showed a prominent expression of CNPase. GFAP expression was modulated in both species by different culture conditions whereas the CNPase expression was unaffected by differences in culture media. Addition of bone morphogenetic protein 4 lead to an increased GFAP expression in both murine and canine satellite glial cells. Regarding their functional properties, canine satellite glial cells caused an increased neurite outgrowth in neurons isolated from dorsal root ganglia.

Taken together, obtained results suggest that satellite glial cells possess properties of astrocytes and oligodendrocytes and represent an intermediate cell type combining potential regenerative properties of both central and peripheral glial cells making satellite glial cells interesting for future cell transplantation strategies.

keywords

translational, Satellitenzellen, Schwann Zellen ; translational, satellite glial cells, Schwann cells

kb

1.282