Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sarah Eva Laue

Galektine in Uterus und Plazenta des Rindes: in vivo‑Expression und -Lokalisation post partum vor und nach induzierter lokaler Inflammationsreaktion mit begleitenden funktionellen in vitro-Studien

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105027

title (engl.)

Galectins in bovine uterus and placenta: in vivo expression and localization post partum before and after induction of a local inflammatory reaction and accompanying functional in vitro studies

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/laues_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Die postpartale (Endo-) Metritis stellt ein wichtiges Problem in der heutigen Milchviehzucht dar. Welche Faktoren die Entstehung einer Erkrankung begünstigen ist bislang aber noch nicht genau bekannt. Peripartal gelangen Milchkühe häufig in eine negative Energiebilanz, die u. a. durch eine reduzierte systemische IGF‑1‑Konzentration gekennzeichnet ist. Tiere mit erniedrigten IGF-1-Spiegeln um den 248. Tag p.i. weisen eine signifikant höhere Inzidenz postpartaler Erkrankungen auf. In vorangehenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die lokale uterine bzw. plazentomäre Galektinexpression ante partum (275. Tag p.i.) durch die IGF-1-Serumkonzentration reguliert wird. Galektine stellen eine Gruppe immunregulatorischer, β-Galaktosid-bindender Lektine dar und sind möglicherweise an der Modulation der lokalen Immunantwort im bovinen Uterus sowie an der Entstehung der postpartalen (Endo-) Metritis beteiligt. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression und Lokalisation von Galektinen im bovinen Plazentom post partum sowie nach Applikation von LPS in Karunkel und interkarunkulärem Endometrium von Kühen auf mRNA- und Proteinebene nachzuweisen, diese in Vergleich zur Situation ante partum zu setzen, sowie den Einfluss der IGF-1-Serumkonzentration auf die Galektinexpression post partum zu untersuchen. Da Galektine außerdem zelluläre Funktionen, wie Proliferation, Migration oder Differenzierung beeinflussen, könnten sie zusätzlich eine Rolle bei der Plazentation des Rindes spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde deshalb mit Hilfe eines Zellkulturmodells der Einfluss von Galektinen auf bovine plazentare Zellen in vitro untersucht. Neben Galektinen gibt es noch weitere Wachstumsfaktoren und Hormone, die für die Entwicklung und Funktion der bovinen Plazenta von Bedeutung sein könnten. Mögliche Kandidaten sind IGF-1, GH und Schilddrüsenhormone. Analog zur funktionellen Galektin-Studie wurde im dritten Abschnitt der vorliegenden Arbeit der Effekt dieser drei Faktoren auf bovine plazentare Zellen in vitro untersucht. Für die in vivo-Studie wurden Milchkühen (n=12) direkt nach der Kalbung Plazentome entnommen. Nach Abgang der Nachgeburt erhielten die Tiere eine intrauterine LPS-Infusion um eine lokale Entzündungsreaktion auszulösen. Drei Stunden später wurden dann Karunkeln und interkarunkuläres Endometrium entnommen. Mittels IHC erfolgte der Nachweis und die Lokalisation von Galektin-1, ‑3, -4, und -9 auf Proteinebene sowie mit Hilfe der RT-qPCR die quantitative Untersuchung der mRNA-Expression von Gal-1, -3, -4, -9 und -13. Die Einteilung der Versuchstiere in die Gruppen IGF-high bzw. IGF-low ergab sich aus der IGF‑1‑Serumkonzentration am 248. Tag p.i. Für die in vitro-Studien wurden bovine Karunkelepithelzellen (BCEC), Trophoblastzellen (F3), plazentare Fibroblasten und Endothelzellen (BUVEC) mit rekombinantem Gal-1, -3, -4 bzw. IGF-1 oder bovinem GH und T3 stimuliert und ihr Einfluss auf Proliferation (MTT-Assay) und Motilität (Live Cell Imaging) der Zellen untersucht. Nach Stimulation mit IGF-1 erfolgte zusätzlich die Detektion von pMAPK42/44 mittels Western Blot. Die stärkste Expression von Gal-1 befand sich in Blutgefäßwänden sowie im maternalen Stroma. Im Str. reticulare des interkarunkulären Stromas zeigten insbesondere gefäß- und drüsenassoziierte Bindegewebszellen eine deutliche Reaktion. Das maternale Epithel von Plazentom/Karunkel und interkarunkulärem Endometrium stellte sich ebenfalls positiv dar. Im Bereich von Chorionplatte und Primärzotten zeigten vereinzelte Zellen des fetalen Mesenchyms ein starkes Signal. Gal-3 konnte v. a. im maternalen Epithel und fetalen Mesenchym sowie schwächer im mononukleären Trophoblasten nachgewiesen werden. Außerdem befanden sich subepithelial im Stroma des interkarunkulären Endometriums vereinzelt positive Zellen. Gal-4 wurde in erster Linie vom maternalen Epithel, Drüsenepithel und Blutgefäßen exprimiert. In der Karunkel nach LPS konnte eine Hochregulation der stromalen Gal-4-Expression beobachtet werden. Die auffälligste Reaktion von Gal-9 zeigte sich in Granula in TGC und fetomaternalen Hybridzellen. Letztere wiesen in der Karunkel nach LPS keine granuläre sondern eine perinukleäre Färbung auf. Im interkarunkulären Endometrium wurde Gal-9 primär vom luminalen und glandulären Epithel und geringer vom Stroma exprimiert. Weder Protein- noch mRNA-Expression wiesen signifikante Unterschiede zwischen den Vergleichsgruppen (IGF-high/-low) auf. In vitro steigerte Gal-1 signifikant die Motilität von F3 und Fibroblasten, Gal-3 die Motilität von BCEC, F3 und Fibroblasten und Gal-4 die Motilität aller untersuchten Zellarten. Keines der Galektine hatte einen Effekt auf die Zellproliferation. Die Stimulation mit IGF-1 führte zu einer signifikanten Erhöhung der Proliferation von BCEC, F3 und Fibroblasten, zu einer signifikanten Steigerung der Motilität aller untersuchten Zellarten sowie zu einer Aktivierung des MAPK42/44-Signalwegs in F3 und Fibroblasten. GH stimulierte die Motilität von BCEC und F3-Zellen. T3 förderte signifikant die Motilität von BCEC, F3 und BUVEC. Weder GH noch T3 hatten einen Einfluss die Zellproliferation in vitro. Aufgrund ihres spezifischen postpartalen Expressionsmusters, welches teilweise Unterschiede zur Situation kurz vor der Geburt (275. Tag p.i.) aufweist, könnten Galektine beim Rind an der Ablösung der Nachgeburt, der Regeneration des Endometriums sowie an der Modulation der uterinen Immunreaktion post partum beteiligt sein. Präpartale Unterschiede der IGF-1-Konzentration im Serum haben jedoch keinen Einfluss auf die lokale Galektinexpression in Uterus und Plazenta post partum. Durch ihre Fähigkeit die Motilität boviner plazentarer Zellen in vitro zu stimulieren sind Galektine möglicherweise auch an wichtigen Prozessen im Rahmen der Plazentation, wie dem Remodeling von Gewebe, der Invasion des Trophoblasten oder der plazentaren Angiogenese, beteiligt. Aufgrund ihres Einflusses auf fundamentale zelluläre Vorgänge sind auch IGF-1, GH und T3 als potentielle Mediatoren der bovinen Plazentation zu betrachten.

abstract (englisch)

Today postpartal (endo-) metritis is a common problem in dairy farming. The factors which contribute to the manifestation of postpartal uterine diseases still have to be identified. In the peripartum period dairy cattle often suffer from a state of negative energy balance, which is characterized amongst others by a reduced IGF-1 serum concentration. Individuals showing lower systemic IGF-1 concentrations around day 248 p.i. have a higher incidence of developing postpartal diseases than unaffected cows. In preceding studies it could be shown that the local uterine and placentomal galectin expression profile prepartum (day 275 p.i.) is regulated by the IGF-1 serum concentration. Galectins represent a family of immunoregulatory, β-galactoside-binding proteins which are possibly involved in the modulation of the local immune response in the bovine uterus and consequently influence the development of postpartal (endo-) metritis in cattle. Therefore the aim of this study was to determine the mRNA and protein expression and localization of galectins in the bovine placentome post partum as well as in the caruncle and intercaruncular endometrium after administration of LPS, to compare these findings with the situation prepartum and to assess the influence of prepartal serum IGF-1 concentrations on the post partum galectin expression. Apart from their immuno-modulatory properties galectins are able to influence various cellular functions such as proliferation, migration or differentiation. Thus they could also play a role in bovine placentation. Therefore the second part of this work dealt with the effects of galectins on a cell culture model of the bovine placenta. Apart from galectins there are a lot more growth factors and hormones that may be involved in the development and maintenance of the bovine placenta throughout pregnancy. In this respect IGF-1, GH or thyroid hormones represent potential candidates. In the third part of this thesis their influence on important cellular functions of bovine placental cells in vitro has been studied. For the in vivo studies the placentomes of 12 dairy cows were collected after spontaneous delivery of the calf. After expulsion of the afterbirth the animals received an intrauterine infusion with LPS to provoke a local inflammatory reaction. Three hours later caruncles and intercaruncular endometrium were collected. Protein expression and localization of gal-1, -3, -4 and -9 was assessed by immunohistochemistry and quantitative realtime PCR was used to determine the mRNA expression of the galectins-1, -3, -4, -9 and -13. The animals were grouped according to their IGF-1 serum concentrations on day 248 p.i. into an IGF-high- and IGF-low-group. For the in vitro studies bovine caruncular epithelial cells (BCEC), trophoblast cells (F3), placental fibroblasts and endothelial cells (BUVEC) were stimulated with recombinant gal-1, -3, -4 or IGF-1 as well as bovine GH and T3 and their effects on cell proliferation (MTT-assay) and cell motility (live cell imaging) were assessed. Additionally; after stimulation with IGF-1 the activation of the MAPK42/44‑pathway was detected by western blot. The strongest expression of gal-1 could be observed in vessel walls and maternal stroma. Fibroblasts in the vicinity of vessels and uterine glands located in the reticular layer of the intercaruncular endometrium showed a very intense signal. The maternal epithelium of placentome, caruncle and intercaruncular endometrium also displayed a positive staining. In the mesenchyme of the chorionic plate and primary fetal villi, scattered cells with a strong reaction could be observed. Gal-3 was localized mainly in maternal epithelium and fetal mesenchyme and to a lesser extent in mononuclear trophoblast cells. Additionally, in the stroma of the intercaruncular endometrium single positive cells could be observed underneath the luminal epithelium. Gal-4 was expressed predominantly by maternal and glandular epithelial cells as well as in blood vessels. In the caruncle after administration of LPS an upregulation of gal-4 protein could be detected in the connective tissue of the maternal stroma. The most striking reaction of gal-9 was observed in granules in TGC and feto-maternal hybrid cells. However, in the caruncle the latter displayed a more perinuclear than granule-associated staining pattern. In the intercaruncular endometrium gal-9 was primarily expressed in luminal and glandular epithelium and to a lesser extent in maternal stroma. Neither protein nor mRNA expression of the galectins differed significantly between the experimental groups. In vitro gal-1 significantly enhanced the motility of F3 and fibroblasts, gal-3 promoted the motility of BCEC, F3 and fibroblasts and gal-4 was able to stimulate the motility of every cell type investigated. None of the galectins had an impact on cell proliferation. The stimulation with IGF-1 lead to a significant increase of the proliferation of BCEC, F3 and fibroblasts, stimulated the motility of every cell line tested and activated the MAPK42/44-pathway in F3 and fibroblasts. GH significantly enhanced the motility of BCEC and F3 cells. Stimulation with T3 provoked an increase in the motility of BCEC, F3 and BUVEC. Both GH and T3 did not affect the proliferation of the cell lines investigated. This specific postpartal galectin expression profile, that revealed indeed some differences compared to the situation shortly before calving (day 275 p.i.), implies a role of galectins in the delivery of fetal membranes, regeneration of the endometrium after birth and modulation of the uterine postpartal immune response. However, prepartal differences in the IGF-1 serum concentration did not affect the local galectin expression in the bovine uterus and placenta post partum. Their ability to enhance the motility in different cell types derived from the bovine placenta further implies that galectins may participate in crucial processes during placentation like tissue remodeling, trophoblast invasion or angiogenesis in cattle. For IGF-1, GH and T3 the in vitro studies clearly have shown that they should be regarded as potential mediators of bovine placentation, too.

keywords

Galektine, Endometritis, Plazenta, galectins, endometritis, placenta

kb

28.527