Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Stefanie Lapp

 

In vivo Untersuchungen über die onkolytische Wirkung des Staupevirus bei dem disseminierten histiozytären Sarkom des Hundes in einem Mausmodell

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104096

Titel (engl.)

In vivo study on the oncolytic effect of canine distemper virus upon the canine disseminated histiocytic sarcoma in a mouse model

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/lapps_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Tumorerkrankungen repräsentieren beim Hund, wie auch beim Menschen, eine der häufigsten Todesursachen. Insbesondere das disseminierte histiozytäre Sarkom stellt eine, wenngleich in der Gesamthundepopulation vergleichsweise selten diagnostizierte, stets mit einer vorsichtigen bis schlechten Prognose assoziierte Tumorerkrankung dar. Das kanine Staupevirus (CDV) ist als Morbillivirus eng verwandt mit dem Masernvirus. Das onkolytische Potenzial des letzteren wurde und wird intensiv erforscht. Beide Viren sind charakterisiert durch die Induktion einer ausgeprägten Immunsuppression durch Zytolyse vornehmlich lymphozytärer Zellen. Die vorliegende Untersuchung stellt die erste Beschreibung einer in vivo CDV-assoziierten Onkolyse einer kaninen Neoplasie dar.

Die Literaturübersicht gibt einen Überblick über das Konzept der viralen Onkolyse und dessen historischen Hintergrund. Gegenwärtig im Fokus der humanmedizinischen Forschung stehende onkolytische Viren werden, mit besonderem Augenmerk auf das Maservirus, vorgestellt sowie erste Schritte der veterinärmedizinisch-relevanten viralen Onkolyseforschung erläutert. Ferner wird ein Einblick in die Herausforderungen und Begrenzungen der Virotherapie gegeben. Es folgt ein Überblick über histiozytäre, proliferative Erkrankungen, die Vorstellung der, in der Studie verwandten, histiozytären Tumorzelllinie DH82 sowie der Staupeerkrankung und des Staupevirus als potenzielles onkolytisches Agens. Weiterhin werden Mausmodelle, wie sie in der onkologischen und virotherapeutischen Forschung vielfach verwendet werden, vorgestellt. Ein weiterer Abschnitt befasst sich mit der Auswirkung des Tumormikromilieus auf die Tumorprogression sowie dessen Bedeutung im Rahmen virotherapeutischer Behandlungen. Hierbei wird der Fokus insbesondere auf die Tumorvaskularisation sowie die tumorassozierte Immunreaktion gelegt. Abschließend werden die Arten des Zelluntergangs sowie deren morphologische Nachweismethoden beleuchtet.

Im Rahmen dieser Studie wurden zum einen subkutane Transplantate der DH82-Zelllinie in Scid-Mäusen generiert, welche nach Erreichen eines im Vorhinein festgelegten Tumorvolumens intratumoral mit dem CDV sowie unterschiedlichen Plazebolösungen injiziert wurden. Es erfolgte die Dokumentation der Tumorvolumenprogression im Vergleich zu nicht-injizierten Kontrolltransplantaten. In einem alternativen Versuchsansatz wurden, in methodisch analoger Vorgehensweise, Transplantate persistierend mit dem CDV infizierter DH82-Zellen (DH82CDVpi-Zellen) erzeugt. Zusätzlich zur Dokumentation der Volumenentwicklung der Tumoren im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrolltransplantaten erfolgte die histologische und immunhistologische Aufarbeitung des Tumorgewebes. Im Zuge dessen wurde die CDV-Infektion der DH82CDVpi-Transplantate immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen das CDV-Nukleoprotein bestätigt. Ferner wurden die Tumoren anhand der Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung, sowie der immunhistologischen Markierung des CD44-Antigens sowie des MHC II-Antigens morphologisch charakterisiert. Zudem wurde die Größe der lichtmikroskopisch nachweisbaren Nekroseflächen HE-gefärbter Tumorschnitte morphometrisch bestimmt sowie der intratumorale Anteil apoptotischer Zellen mittels einer immunhistochemischen Markierung mit Antikörpern gegen aktivierte Caspase 3 determiniert. Es schlossen sich Untersuchungen des Tumormikromilieus an. Hierfür wurde die intratumorale Gefäßdichte durch immunhistochemische Markierung der Tumorgefäße mit einem Antikörper gegen CD31 evaluiert. Ferner erfolgte die immunhistochemische Charakterisierung der peri- und intratumoralen Immunreaktion. Hierfür wurden Antikörper, die gegen murines Mac 3 / CD107b, CD3 und CD45R gerichtet waren, verwendet.

Die intratumoralen Injektionen mit dem CDV bewirkten eine transiente Stagnation der Tumorvolumenprogression. Die mit den Plazebolösungen injizierten sowie die Kontrolltumoren zeigten dagegen ab Beginn des Untersuchungszeitraumes eine stetige Volumenprogression. Ungefähr im letzten Drittel des Untersuchungszeitraumes kam es auch bei den mit dem CDV injizierten Tumoren zu einer Volumenzunahme. Nichtsdestotrotz blieben die Volumina dieser Tumoren im Vergleich zu den Volumina der mit den Plazebolösungen injizierten sowie der Kontrolltumoren maßgeblich kleiner.

DH82CDVpi-Transplantate zeigten im Gegensatz zu den nicht-infizierten Kontrolltumoren eine Volumenabnahme bis hin zur Nichtnachweisbarkeit im Rahmen der makroskopischen wie histologischen Untersuchungen. Als Ursache hierfür wurden markante, großflächige Nekrosen der DH82CDVpi-Tumorareale herausgestellt. Diese traten schon ab dem 7. Tag nach der Transplantation auf. Gleichartige Veränderungen konnten bei den Kontrolltumoren erst zum 77. Tag nach der Transplantation festgestellt werden. Ferner erwies sich die Vaskularisation der DH82CDVpi-Tumoren als signifikant geringer ausgeprägt. Die Charakterisierung der Immunreaktion ergab eine augenscheinlich erhöhte Immunogenität der DH82CDVpi-Tumoren. Bei der differenzierten Betrachtung der Immunreaktion ergab sich ein Makrophagen-dominiertes Geschehen. Größtenteils signifikant geringgradiger stellte sich die Infiltration CD3- und CD45R-positiver Zellen dar. Ihre nichtsdestotrotz potenzielle Bedeutung im Rahmen des Regressionsgeschehens wird diskutiert.

Abschließend lässt sich feststellen, dass dem CDV eine onkolytische Wirkung auf Transplantate histiozytärer Tumorzellen in immunsupprimierten Mäusen zugesprochen werden kann. Diese verdeutlichte sich in einer transienten Volumenstagnation der intratumoral infizierten Transplantate sowie in der vollständigen Regression der persistierend CDV-infizierten Tumoren. Die Ergebnisse der immunhistologischen Untersuchungen zeigen, dass die Pathogenese dieser Regressionen mit einer unterdrückten Tumorvaskularisation und der assoziierten Immunreaktion im Zusammenhang steht.

 

abstract (englisch)

Neoplastic diseases represent one of the most common causes of death in dogs as well as in humans. Particularly the canine disseminated histiocytic sarcoma constitutes a neoplastic disorder that is commonly associated with a guarded or poor prognosis, though, in reference to the total dog population, it remains infrequently diagnosed. The canine distemper virus (CDV) is, being a morbillivirus, closely related to the measles virus. The oncolytic potential of the latter is and has been intensively studied. Both viruses are characterized by the induction of a marked immunosuppression mainly caused by cytolysis of lymphocytic cells. The present study represents the first in vivo description of CDV-associated oncolysis of a canine tumor.

The literature review provides an overview of the viral oncolysis concept and its historical background. Oncolytic viruses that are at the focus of many current studies are introduced. Herein special attention is given to oncolytic measles viruses as well as to first attempts of viral oncolysis in veterinary oncology. Furthermore challenges and restraints of virotherapies are explained. An overview of proliferative histiocytic disorders follows. The canine histiocytic cell line DH82, which is applied in the course of this study is introduced as well as CDV as a potential oncolytic agent. In addition mouse models frequently used in oncology and virotherapy research are described. A further section deals with the influence of the tumor microenvironment on tumor progression and its relevance to virotherapeutic treatments. Within this context special attention is given to tumor angiogenesis and tumor-associated immune reactions. Concluding, various aspects of cellular degeneration as well as different methods of its detection are highlighted.

In the course of this investigation, subcutaneous xenografts of DH82 cells were generated in scid mice, which received intratumoral injections of CDV and different placebos respectively, after the tumor had reached the a priori defined tumor volume. Tumor volumes were measured and documented in comparison to non-injected control DH82 grafts. Furthermore, an alternative approach was applied, which involved the grafting of DH82 cells that were persistently infected with CDV (DH82CDVpi cells). In addition to measurement and documentation of tumor volumes, tumor specimens were analyzed by histology and immunohistochemistry. Thus, the CDV-infection of the DH82CDVpi-grafts was confirmed. Tumor tissue was stained with hematoxylin and eosin (HE) as well as with antibodies directed against CD44 and MHC class II-antigen. Moreover, microscopically detectable areas of necrosis were morphometrically measured and intratumoral fractions of apoptotic cells evaluated by immunohistochemical staining applying an antibody directed against cleaved caspase 3. Furthermore, intratumoral vessel density was evaluated by CD31 immunohistochemical staining and counting of intratumoral vessels. Furthermore the peri- and intratumoral immune reaction was immunohistochemically characterized applying antibodies directed against murine Mac 3 / CD107b, CD3 and CD45R.

Intratumoral CDV injections lead to a transient stagnation of tumor volume progression, whereas placebo-injected tumors displayed a constant volume increment. Approximately within the last third of the observation period also CDV-injected tumors showed increasing volumes. Nevertheless these tumors remained significantly smaller compared to placebo-injected or non-injected control tumors.

DH82CDVpi tumors, in contrast to non-infected control tumors, macroscopically and histologically showed a constant reduction in tumor volume up to nondetectability. Marked and widespread necroses within DH82CDVpi tumor areas were reasoned to be the cause for this phenomenon. These were detected as early as 7 days after transplantation, whereas in non-infected control tumors necrotic areas increased only on day 77 post transplantation. Moreover, intratumoral vascular density proved to be significantly less developed. The characterization of the tumor-associated immune reaction demonstrated that the DH82CDVpi tumors appear to be more immunogenic. A differential analysis of the immune reaction revealed, that the inflammatory response is dominated by macrophages. The infiltration by CD3- and CD45R-positive cells was less pronounced. Nevertheless these cells might be of importance regarding the regression process. The according relevance is being discussed.

Concluding, it can be assumed that CDV has an oncolytic potential upon xenografts arising from canine histiocytic tumor cells in immunosuppressed mice. This potential is represented by a transient stagnation of intratumorally CDV-injected grafts as well as by persistently CDV-infected grafts displaying complete regressions. Immunohistochemical studies upon the tumor microenvironment reveal the pathogenesis of regression to be associated with inhibited angiogenesis and the accompanying immune reaction.

keywords

virale Onkolyse, kanines Staupevirus, histiozytäres Sarkom, viral oncolysis, canine distemper virus, histiocytic sarcoma

kb

29.961