Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Anina Labudda

Experimentelle Untersuchungen zur Alterung porziner Eizellen in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105003

title (engl.)

Experimental studies on ageing of porcine oocytes in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/labuddaa_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand funktioneller und biochemischer Parameter die Auswirkungen einer experimentell induzierten Eizellalterung beim Schwein näher zu charakterisieren.

 

In einem ersten Versuchsabschnitt, der der Feststellung des Kernreifungsverlaufs und der Chromatinmorphologie während der Alterung diente, erfolgte die In-vitro-Maturation (IVM) der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) über 0, 26, 46, 58 und 72 h in Whitten‘s Medium mit 3,0 μg/ml bovinem Serumalbumin (BSA), das nur in den ersten 24 h Luteinisierendes und Follikelstimulierendes Hormon (LH 5,0; FSH 2,5 μg/ml) enthielt. Die KOKs wurden nach dem jeweiligen Kultivierungzeitpunkt denudiert, fixiert und mit Aceto-Orcein-Lösung gefärbt. Mindestens 100 Eizellen wurden pro Gruppe ausgewertet. Zusätzlich wurden jeweils mindestens drei Gruppen á 40 Oozyten zu den Zeitpunkten 0, 26 und 46 h für die spätere Analyse der MAPK-Aktivität tiefgefroren und mit den Eizellen des dritten Versuchsabschnitts gemeinsam ausgewertet.

 

Im zweiten Versuchsabschnitt erfolgte die Feststellung der Ausschleusung des ersten Polkörpers (1. PK) unter dem Stereomikroskop (90fache Vergrößerung) an der vitalen Oozyte nach der IVM-Phase (46 h). Für die weitergehenden Experimente des zweiten und dritten Versuchsabschnitts wurden ausschließlich Eizellen verwendet, bei denen sich der 1. PK eindeutig nachweisen ließ. Die Oozyten wurden nach der Polkörperkontrolle unter gleichbleibenden Bedingungen einer In-vitro-Alterung über 12 (58 h) und weiteren 14 h (72 h) unterzogen. Im Anschluss an die jeweiligen Kultivierungsphasen (46, 58 und 72 h) wurden die Oozyten mit Ethanol/Cycloheximid aktiviert (24stündige Proteinsynthesehemmung in Anwesenheit von 10μg/ml Cycloheximid), gewaschen und für weitere 24 h inkubiert. Am Ender dieser 94-, 106- und 120stündigen Inkubationsphase wurden die Teilungsaktivität, die Degenerations- und Fragmentationshäufigkeit sowie der Chromatinstatus nach Aceto- Orceinfärbung an mindestens 100 Oozyten pro Gruppe ermittelt.

 

Im dritten Versuchsabschnitt wurden die Oozyten nach der Polkörperkontrolle unter gleichbleibenden Bedingungen einer In-vitro-Alterung über 12 h (58 h) und weiteren 14 h (72 h) unterzogen. Im Anschluss erfolgte die Tiefgefrierung von jeweils mindestens drei Gruppen à 40 Oozyten zu den Zeitpunkten 58 und 72 h für die spätere Analyse der MAPK Aktivität.

Als wesentlichstes Ergebnis der ersten Experimentalreihe, bei der die Dynamik der Degenerationsanzeichen und der Kernreifungsverlauf in den Oozyten während der Kultivierungszeitspanne zwischen 48 und 72 h ermittelt wurde, liegt in der Beobachtung, dass es erst im zweiten Abschnitt dieser verlängerten Inkubationsphase (58–72 h) zu einer signifikanten Zunahme des Anteils an fragmentierten und degenerierten Oozyten kam. Die detektierten Zelluntergangsanzeichen betrafen dabei zu etwa gleichen Teilen sowohl das Ooplasma (Zytofragmentation) als auch das Chromatin (Chromosomen, die nicht in der Äquatorialebene lagen, defekte Spindelphänotypen).

 

Das Hauptergebnis der Versuche zur parthenogenetischen Aktivierung alternder Schweineeizellen ist in der nahezu gleichbleibenden Entwicklungsrate (ca. 40-50 %) mehrzelliger Parthenogenone (MZ) bei zunehmender Alterung zu sehen. Zwar kam es mit länger werdender Kultivierungszeit zu einer Verminderung der MZ, die von einem signifikanten (P<0,05) Anstieg der PN-Stadien begleitet wurde, jedoch ließ sich die Ausgangshypothese, dass mit zunehmender Eizellalterung um ca. 24 h die parthenogenetische Aktivierbarkeit der Schweineizelle kontinuierlich ansteigt, nicht sicher belegen. Die eigenen Resultate deuten eher auf einen diskontinuierlichen Anstieg der Aktivierbarkeit hin.

 

Bei der Analyse des biochemischen Parameters wurde ermittelt, dass die MAPK-Aktivität in den ersten 12 h der In-vitro-Alterung um etwa 25 % abnimmt, während sie sich in den darauffolgenden 14 h um ca. 15 % vermindert. Diese Beobachtung stimmt mit Befunden beim Schwein, dem Rind und der Maus überein.

 

Zukünftige Untersuchungen müssten sich auf die verminderte Aktivität der p90rsk, dem Hauptsubstrat der MAPK in der Schweineeizelle, und dann dem Zusammenhang zwischen der reduzierten p90rsk und der zunehmenden Dissoziation von Emi2 und dem APC/C mit anschließender Cyclin B-Synthese fokussieren.

abstract (englisch)

The aim of the present study was to characterize effects of experimentally induced oocyte aging using functional and biochemical parameters.

In a first series of experiments nuclear maturation kinetics and chromatin changes during prolonged in vitro maturation (IVM) periods were determined. Cumulus oocyte complexes (COCs) were matured in Whitten's medium supplemented with 3.0 μg/ml bovine serum albumin (BSA) for 0, 26, 46, 58 and 72 h. Luteinizing and follicle stimulating hormone; (LH 5.0, FSH 2.5 μg/ml) were added only during the first 24 h of culture. Following in vitro culture COCs were denuded, fixed and stained with aceto-orcein. At least 100 oocytes were analyzed culture interval. In addition, at least three groups each of 40 oocytes were frozen for later analysis of MAPK following culture for 0, 26 and 46 h. These samples were evaluated together with the oocytes of the third experimental series.

 

In a second series of experiments the presence of the first polar body (PB) was determined in the vital oocyte under a stereo microscope (magnification 90 times) following IVM for 46 h. Only oocytes exhibiting an extruded first PB were used for further experiments. The oocytes were subjected to in vitro aging for 12 (58 h) and further 14 h (72 h) under constant conditions. Following incubation for 46, 58 and 72 h oocytes were activated with ethanol / cycloheximide (24-h protein synthesis inhibition in the presence of 10μg/ml cycloheximide), washed and cultured for a further 24 h cultivation period. At the end of this 94-, 106- and 120 hours incubation phase, cleavage activity, degeneration and fragmentation rate were determined by aceto-orcein staining. At least 100 oocytes per group were evaluated.

 

In a third series of experiments oocytes with an extruded first PB were subjected to in vitro aging for 12 (58 h) and a further 14 h (72 h). At least three samples each of 40 oocytes were collected and frozen for subsequent analysis of MAPK activity at culture intervals of 58 and 72 hours.

 

The most essential result of the first series of experiments where nuclear kinetics and degeneration rates were determined during prolonged IVM for 72 h is the observation that a significant increase in the proportion of fragmented and degenerated oocytes occurred only late during in vitro aging (58-72 h). Equal parts of cell death signs were detected in the ooplasm (fragmentation) and the chromatin (chromosomes out of equatorial plane, deviant mitotic spindel) of these aged oocytes.

Parthenogenetic activation capacity [(development of multicellular parthenogenones (MZ)] of in vitro aged porcine oocytes remained at a constant rate (40-50%) despite increasing culture durations. Although a reduction of MZ (P<0.05) accompanied by a significant increase of pronuclei stages was observed, the initial hypothesis predicting a continuously increase of parthenogentic activation capacity with increasing oocyte aging by about 24 h could not be confirmed. The own results suggest rather a discontinuous increase in the parthenogentic activation capacity.

 

Analysis of the biochemical parameter demonstrated that the MAPK activity decreased by about 25 % during the first 12 h of in vitro aging while it declined in the subsequent 14 h by about 15 %. This observation is consistent with published findings in pig, bovine and mouse oocytes.

 

Future studies should be directed to confirm the declining activity of p90rsk during aging. The p90rsk is the main substrate of MAPK in the porcine oocyte and influences Emi2 directly which in turn dissociates from APC/C due to decreasing p90rsk activities. This should be followed by an increase of cyclin B synthesis.

keywords

Eizellalterung, MAPK, in–vitro-Maturation, oocyte ageing

kb

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