Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Linda Cecile Kwasnitschka  

 

 

Untersuchungen zum Vorkommen von Fledermaus-assoziierten Virusinfektionen in Deutschland und zur Diagnostik und molekularen Pathogenese Flughund-assoziierter zoonotischer Paramyxoviren

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108255

title (engl.)

Prevalence of Bat-associated Viral infection including Diagnostics and Molecular Pathogenesis of bat-associated Zoonotic Paramyxo Viruses

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kwasnitschkal_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Ein Ziel dieser Arbeit war die Analyse unterschiedlicher Fledermauspopulationen auf das Vorkommen von Adeno-, Corona-, Astro- und Paramyxoviren. Auf diese Weise sollten Viren mit ausreichender Prävalenz identifiziert werden, um diese in weiteren Untersuchungen als Marker für soziale Interaktionen zwischen Fledermauskolonien und Einzeltieren zu verwenden. Darüber hinaus sollte durch eine phylogenetische Einordung ein eventuelles Zoonose-Potential der gefundenen Viren eingeschätzt werden. Dafür wurde Probenmaterial von Fledermäusen aus ausgewählten Standorten molekulardiagnostisch mittels PCR untersucht sowie die Nukleinsäuresequenzen positiver Proben phylogenetisch analysiert. Auf diese Weise konnten Teilsequenzen aller gesuchten Viren gewonnen werden. Die Prävalenzen der einzelnen Viren waren hierbei sehr heterogen. Für Corona- und Adenoviren wurden durchschnittliche Prävalenzen von je 1 % festgestellt, während Astroviren abhängig von der jeweils beprobten Kolonie mit Prävalenzen von bis zu 45 % vorkamen. Damit kamen Astroviren ausreichend häufig vor, um weiterführende Untersuchungen im Hinblick auf die Übertragung zwischen den Tieren durchführen zu können. Die phylogenetischen Analysen der nachgewiesenen Adeno-, Corona-, Astro- und Paramyxoviren ergaben keine Verwandtschaft zu bekannten Pathogenen. Zur Virusisolation wurden Paramyxovirus-positive Proben schließlich auf verschiedenste eukaryotische Zelllinien appliziert, ohne jedoch eine Virusvermehrung festzustellen. Dagegen konnte aus einem infizierten embryonierten Hühnerei paramyxovirale-RNA amplifiziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass embryoniete Hühnereier zur Anzucht von Fledermaus-Paramyxoviren geeignet sein können.

Für serologische und molekularbiologische Untersuchungen zu Henipaviren wurden polyklonale Antikörper gegen das Matrix-, das Nukleokapsid- und das Fusions-Protein sowie zusätzlich monoklonale Antikörper gegen das Matrix- und das Nukleokapsidprotein generiert. Diese Antikörper wurden durch Westernblot und Immunfluoreszenz validiert. Zusätzlich wurde ein indirekter ELISA entwickelt, der auf dem rekombinanten Nukleokapsidprotein des Hendravirus basiert. Da diese Proteine des Hendra- und des Nipahvirus serologisch kreuzreaktiv sind, sollte der ELISA zum speziesunabhängigem Nachweis beider Viren dienen. Der Test war tatsächlich in der Lage Hendra- oder Nipahvirus positive Schweine- bzw. Pferde-Seren nachzuweisen. Vereinzelt kam es zu unspezifischen Reaktionen, die bislang noch nicht unter BSL4-Bedingungen mit einem VNT überprüft werden konnten.              

Die Antiseren gegen das Matrix- und das Fusionsprotein kamen des Weiteren bei verschiedenen molekularbiologischen Untersuchungen zum Einsatz. Hier wurden sie in erster Linie dazu genutzt, die Expression und Verteilung der Hendraproteine in mit Plasmiden transfizierten Zellen mittels Immunfluoreszenz sichtbar zu machen. Darüber hinaus sollte die Interaktion der viralen Proteine mit dem zellulären Rezeptor, dem Ephrin B2-Liganden untersucht werden. Zur externen Steuerung aller für die Fusion der Zellmembranen und somit für die Bildung von Synzytien notwendigen Proteine wurde Ephrin B2 ebenfalls in einen Expressionsvektor kloniert. Hierbei zeigte sich eine vollständige Inhibition der Bildung von Synzytien bei Kotransfektion des Plasmides für Ephrin B2 sowohl in Rezeptor-defizienten als auch in Rezeptor-tragenden Zellen. Diesem Effekt könnte eine Überexpression des Ephrin B2-Rezeptors zugrunde liegen. Dies sollte durch weitere Versuche mit unterschiedlichen Mengen an transfiziertem Ephrin B2 überprüft werden. Daher wurden weitere Studien zur Hendra-Protein vermittelten Zellfusion in Zellen mit endogener Expression des Rezeptors durchgeführt. Hierzu wurden Zellen mit den Plasmiden für die Hendraproteine transfiziert sowie Peptide zugesetzt, die einen in der Literatur bereits beschriebenen inhibitorischen Effekt auf die Zellfusion haben. Diese Fusionsinhibition konnte in den transfizierten Zellen wie erwartet reproduziert werden. Dieses Modell zur Überprüfung der Fusionsinhibition kann in Zukunft zum Test von Therapeutika dienen, die an diesem Punkt der viralen Infektion angreifen. Um diesem Test quantifizierbare Aussagen entnehmen zu können, wurde er zu einem Luziferase-Assay erweitert. Hierbei wird das Ausmaß der Zellfusion mittels optischer Messung des Signals einer Reporter- und einer Kontroll-Luziferase bestimmt. Bei der Etablierung dieses Testes zeigte sich jedoch, dass die Expression der Kontroll-Luziferase, die eine Aussage über eine erfolgreiche Transfektion der Zellen sowie Protein-Expression geben soll, ungewünschte Abhängigkeiten zum Aktivator-Plasmid der Reporter-Luziferase aufweist. Daher bedarf dieser Test einer weiteren Optimierung, wie etwa der Wahl eines anderen Plasmides für die Kontroll-Luziferase.

 

abstract (englisch)

Aim of this study was the assessment of different bat populations for the presence of adeno-, corona-, astro- and paramyxoviruses. Provided there are significant viral prevalences, these viruses should function as social markers regarding interactions between different bat colonies and individual bats. Furthermore, the zoonotic potential of those detected viruses should be estimated by phylogenetic analyses. Consequently, different bat colonies were sampled and molecular analyses comprising PCR and phylogenetic studies on positive material were performed. Partial sequences of all questionable viruses were extracted, yet at varying prevalence rates. Corona- and adenoviruses showed average prevalences of 1 %, while astroviruses could be detected at values of more than 45 % in individual bat colonies. Thus, astroviruses showed a sufficient prevalence in order to conduct further studies regarding the transmission of these viruses across bats.  Phylogenetic analyses of the identified adeno-, corona, astro- and paramyxoviruses showed no relationship to any known pathogen. In order to isolate paramyxoviruses, a variety of eukaryotic cell lines were exposed to paramyxovirus-positive samples, yet without obtaining detectable viral replication. Nevertheless, paramyxovirus RNA was successfully amplified from an infected embryonated chicken egg. These findings suggest that successful viral isolation of bat paramyxoviruses should be achieved in principle by using embryonated chicken eggs.

In order to conduct serological and molecular assays for henipaviruses polyclonal antibodies for matrix-, nucleocapsid- and fusion protein detection as well as monoclonal antibodies against the matrix- and nucleocapsidprotein were established. These antisera were validated using western blot and immunofluorescence. In addition to that, an indirect ELISA based on the recombinant Hendra virus nucleocapsid protein was developed. Because of the serological cross reactivity of Hendra- and Nipah virus nucleocapsid proteins, the ELISA was supposed to detect both Hendra- and Nipah virus species independently. This assay was indeed able to detect hendra or nipah positive pig and horse sera. Scattered unspecific reactions could not yet be clarified by VNT verification under BSL4 conditions.

Additionally, the antisera directed against matrix- and fusion proteins were applied in various molecular assays. They were primarily used to visualize both value and pattern of Hendra protein expression shown by immunofluorescence of plasmid transfected cells. In a next step the interaction of the viral proteins and their cellular receptor, ephrin B2, was studied. To facilitate the external control of proteins participating in attachment and fusion and therefore in the formation of syncytia essentially, the ephrin gene was cloned into an expression vector. Yet coexpression of ephrin B2 resulted in complete inhibition of syncytia formation both in ephrin B2 deficient cells as well as in those expressing endogenous ephrin B2. This effect could be caused by overexpression of ephrin B2 and should be verified by further studies using varying amounts of transfected ephrin B2. Therefore, further experiments on Hendra protein mediated cell fusion were performed using cells showing endogenous ephrin B2 expression. Peptides known to inhibit formation of syncytia in cell culture were added to cells transfected by plasmids encoding Hendra virus proteins. This inhibition was confirmed in transfected cells as anticipated. This assay is designed to provide a model of controlled fusion inhibition and can thus serve as a test for viral therapeutics intervening with the virus induced cell fusion. To enable the quantification of results, the assay was adjusted by the additional application of luciferases. Thereby, the extent of syncytia formation was determined by optical measurement of one reporter and one control luciferase. While validating the results of this assay, the expression of the control luciferase, which serves as control for successful transfection and protein expression, was found to be dependent on the activator plasmid of the reporter luciferase. Therefore, this assay needs further optimization like the selection of a different plasmid coding the control luciferase.  

 

keywords

Fledermäuse, Viren, Diagnostik, bats, virus, diagnostic

kb

3.781