Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Kristin Kullik

Interactions between the mycotoxin deoxynivalenol and lipopolysaccharides on the protein metabolism and the immune system of pigs

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105718

title (ger.)

Wechselwirkungen zwischen dem Mykotoxin Deoxynivalenol und Lipopolysacchariden auf den Proteinstoffwechsel und das Immunsystem bei Schweinen 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kullikk_ws14.pdf

abstract (deutsch)

In nördlich gemäßigten Regionen ist das Getreide häufig mit dem Fusarium Toxin Deoxynivalenol kontaminiert. Dies kann nicht vollständig verhindert werden. Das Standardfutter für Schweine enthält vornehmlich Weizen, Gerste und Mais. Daher ist das Risiko, dass Schweine diesem Mykotoxin ausgesetzt sind besonders hoch. Abgesehen davon, ist das Schwein die als am anfälligsten geltende Spezies bezüglich einer Exposition mit DON, die nach einer Belastung mit hohen Toxindosen Vergiftungserscheinungen wie Futterverweigerung, Erbrechen und Diarrhoe zeigt. Die primären wirtschaftlichen Verluste werden allerdings durch eine verminderte Lebendmassezunahme und reduzierte Futteraufnahme nach einer chronischen Belastung mit moderaten DON Gehalten verursacht. Die primäre toxische Wirkung von DON ist die Hemmung der Proteinsynthese durch Wechselwirkungen mit der 60S Untereinheit von eukaryotischen Ribosomen und die Modulation des angeborenen Immunssystems. Es wird angenommen, dass diese Wirkmechanismen für eine verminderte Resistenz des Wirtes gegenüber Pathogen-assoziierte molekulare Muster (engl. PAMPs), wie zum Beispiel Lipopolysaccharide (LPS) verantwortlich sind. LPS sind intrinsische Bestandteile der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien, welche ubiquitär in den Futtermitteln und der Umgebung in der Schweinhaltung aber auch im Darmlumen der Tiere vorkommen. Ähnlich wie DON, aktivieren LPS das angeborene Immunsystem, was teilweise über einen ähnlichen molekularen Wirkmechanismus geschieht. Daher sind Wechselwirkungen zwischen DON und LPS auf das angeborene Immunsystem und den Proteinstoffwechsel möglich. Dies konnte teilweise in Zelllinien und Nagern, welchen hohe Toxindosen verabreicht wurden, bestätigt werden. Bei Schweinen wurden diese Beeinträchtigungen allerdings noch nicht in vivo untersucht. Deshalb zielt die vorliegende Arbeit auf die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen DON und LPS auf die in vivo Proteinsynthese in Geweben, welche eine bestimmte Rolle bei der Entzündung und Toxinausscheidung spielen, sowie auf ausgewählte immunologische Parameter ab.

Für diesen Zweck wurden 36 männlich kastrierte Schweine einer Zweirassenkreuzung (Deutsche Landrasse × Pietrain) verwendet, welche entweder mit einem natürlich mit DON kontaminierten Futter (3 mg DON/kg Futter) oder mit einem unkontaminierten Kontrollfutter für 5 Wochen gefüttert wurden. Am Tag der Probensammlung und der Bestimmung der Proteinsynthese wurde den Schweinen, welche das Kontrollfutter erhielten entweder eine einstündige Infusion mit physiologischer Kochsalzlösung, 100 µg DON/ kg Lebendmasse (LM), 7.5 µg LPS/kg LM oder eine Kombination der beiden Toxine mit der jeweils selben Dosis wie die individuelle Infusion, verabreicht. Schweinen, welchen DON kontaminiertes Futter gefüttert wurde, wurden in zwei Gruppen unterteilt, welchen entweder physiologische Kochsalzlösung oder 7.5 µg LPS/kg LM über eine Stunde infundiert wurde. Die Auswirkungen von DON und LPS auf die Proteinsynthese im Gewebe und die Synthese von den Akute Phase Proteinen Albumin und Fibrinogen wurden mittels einer “flooding dose” des Stabilisotopes L-[2H5]-phenylalanine gemessen. Diese Technik wurde ebenfalls für die Bestimmung der Proteinsynthese in peripheren mononuklearen Blutzellen (engl. PBMC), welche zu den primären Angriffszielen von DON und LPS zählen, angewendet. Außerdem wurde mittels MTT Untersuchung die zelluläre Lebensfähigkeit der PBMC untersucht. Um die LPS mediierte Akute Phase Reaktion zu verifizieren, wurden die Serumkonzentrationen von den proinflammatorischen Zytokinen Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-α) und Interleukin 6 (Il-6) und dem antiinflammatorischem Zytokin Interleukin 10 (Il-10) bestimmt.

Selbst wenn den Schweinen ein DON kontaminiertes Futter mit einer ungefähr dreifach höheren DON-Konzentration als es der Grenzwert für Ergänzungsfutter- und Alleinfuttermittel für Schweine vorschreibt, gefüttert wurde, war die alleinige Verabreichung von DON unzureichend, um die Proteinsyntheseparameter im Gewebe und die der Albumin-und Fibrinogensynthese und die metabolische Aktivität und zelluläre Lebensfähigkeit der PBMC zu beeinflussen. Desweitern konnten durch DON keine Auswirkungen auf die Serumkonzentration von TNF-α, Il-6 und Il-10 beobachtet werden. Daher kann aufgrund der gemessenen Parameter geschlussfolgert werden, dass die alleinige DON Belastung nicht in der Lage war messbare immunmodulatorische Wirkungen auszulösen. Im Gegensatz dazu, rief die Verabreichung von LPS, ungeachtet einer DON Ko – oder Präexposition, deutliche Effekte auf den hepatischen Proteinstoffwechsel hervor, was dem Anschein nach in direktem Zusammenhang mit der LPS mediierten frühen Phase der Akute Phase Reaktion stand. Dies kann durch den beobachteten typischen Abfall der Albuminsynthese, der unveränderten Fibrinogensynthese und den Veränderungen der Zytokinkonzentrationen untermauert werden. Nichtsdestotrotz, könnten die gemessenen Veränderungen der Sekretionszeit von Albumin durchaus auf Wechselwirkungen zwischen DON und LPS bezüglich der Beschädigung von Hepatozyten hindeuten. Dies muss allerdings kritisch betrachtet werden, da die Relationen teilweise kein signifikantes Niveau erreichten. Außerdem war es nicht möglich eine Aussage über die portale hepatische Exposition mit DON und LPS zu treffen, da lediglich peripher venöses Blut entnommen wurde. Abgesehen davon konnten in PBMC, ungeachtet einer DON Ko- oder Präexposition, LPS mediierte zytotoxische Effekte durch die gemessene verminderte zelluläre Lebensfähigkeit verifiziert werden, wobei die Hemmung der Proteinsynthese unterschiedlich ausgeprägt war. Lediglich in der Milz und dem Dünndarm verstärkte die intravenöse Koexposition mit DON die Auswirkungen von LPS auf einige Proteinsyntheseparameter, wobei eine chronische Präexposition mit DON die Effekte von LPS in der Milz abmilderte. Allerdings gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen LPS Gruppen und der zugrundeliegende Wirkmechanismus der genannten Beeinträchtigungen ist nach wie vor unbekannt. Daher muss geschlussfolgert werden, dass Wechselwirkungen in den anderen Geweben und unter anderen Studienbedingungen, insbesondere der Toxindosen und der Eintrittswege in den Körper, weiterhin abgeklärt werden sollten.

 

abstract (englisch)

In northern temperate regions, cereal grains are frequently contaminated with the Fusarium toxin deoxynivalenol (DON), which can not completely be prevented. The standard diet for pigs predominantly comprises wheat, barley and maize. Therefore, pigs are at special risk to be exposed to this mycotoxin. Moreover, the pig is the most susceptible species to DON, showing overt signs of intoxication such as feed refusal, emesis and diarrhoea following exposure to high toxin amounts. However, the primary economic losses are caused by a diminished live weight gain and reduced feed intake after a chronic exposure to moderate doses of DON. The primary toxic effect of DON is the inhibition of the protein synthesis via interactions with the 60S subunit of eukaryotic ribosomes and the modulation of the innate immune system. These modes of action are assumed to be responsible for a diminished resistance of the host towards pathogen associated molecular patterns (PAMPs) such as lipopolysaccharides (LPS). LPS are intrinsic components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, which ubiquitously occur in feedstuffs and the environment of pig farming, but also in the lumen of the intestinal tract of the animals. Similar to DON, LPS are regarded to activate the innate immune system, which partly occurs with the similar molecular mechanism. Hence, interactions between DON and LPS on the innate immune system and protein metabolism are possible. This could be partly confirmed using high toxin doses in cell lines and rodents. However, these adverse effects have not been yet studied in vivo in pigs. Therefore, the present research aimed to investigate the interactions between DON and LPS on the in vivo protein synthesis in tissues playing specific roles in inflammation and toxin elimination, and selected immunological parameters.

For this purpose 36 male castrated crossbred (German Landrace × Pietrain) pigs were used, which were either fed a naturally with DON contaminated diet (3 mg DON/kg diet) or an uncontaminated control diet for 5 weeks. On the day of sampling and protein synthesis measurement, pigs fed the control diet received an infusion of physiological saline, 100 µg DON/kg live weight (LW)/h, 7.5 µg LPS/kg LW/h or a combination of both toxins at the same dose as the individual infusions, respectively. Pigs fed the DON-contaminated diet were split into two groups, receiving physiological saline or 7.5 µg LPS/kg LW/h. The effects of DON and LPS on tissue protein synthesis and synthesis of the acute phase proteins albumin and fibrinogen were measured using a flooding dose of the stable isotope L-[2H5]-phenylalanine. This technique was also used to investigate the protein synthesis in peripheral blood mononuclear cells (PBMC), which are known to be the primary targets of both DON and LPS. In PBMC the cell viability was also detected via MTT assay. In order to verify the LPS mediated acute phase response, the serum concentrations of the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 6 (Il-6) and the anti-inflammatory cytokine interleukin 10 (Il-10) were determined.

Even if pigs were fed a DON-contaminated diet containing an approximately three-fold higher DON concentration than the guidance value for complementary and complete feedings stuffs regulates for pigs, the DON administration alone was insufficient to alter protein synthesis parameters of tissues and of albumin and fibrinogen synthesis, and the metabolic activity and cell viability of PBMC. Furthermore, DON-effects on serum concentrations of TNF-α, Il-6 and Il-10 could not be observed. Hence, based on the measured parameters it was concluded that the DON exposure alone was not able to cause measurable immune-modulating effects. In contrast, the LPS application evoked distinct effects on hepatic protein metabolism irrespective of a DON co- or pre-exposure, which seemed to be linked to the LPS-mediated early stage of the acute phase response. This could be supported by the observed typical decrease of albumin synthesis, unaltered fibrinogen synthesis and changes in cytokine concentrations. Nonetheless, the determined alterations of the secretion time of albumin could indicate damage of hepatocytes at interactions between DON and LPS. Indeed, this has to be considered critically as relations partly failed to reach significance level. Furthermore, it was not feasible to make any statements about the hepatic DON and LPS exposure via the portal vein, as only peripheral venous blood was collected. Irrespective of a DON co-or pre-exposure, in PBMC the cytotoxic effects of LPS could be proven by the measured diminished cell viability, whereas protein synthesis inhibition was pronounced to different extents. Only in the spleen and small intestine the intravenous DON co-exposure enhanced the impacts of LPS on some protein synthesis parameters, while a chronic oral pre-exposure to DON weakened the effects of LPS in the spleen. Indeed, significances between the individual LPS treated groups were absent and the underlying mode of action of mentioned alterations is still unknown. Hence, it has to be concluded that interactions in other tissues and under other study conditions, especially toxin doses and route of entry into the body, needs to be further clarified.

 

keywords

Deoxynivalenol, Lipopolysaccharide, Schweine, deoxynivalenol, lipopolysaccharides, pigs

kb

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