Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Christin Krüger

 

Wirt-Erreger-Interaktionen in der klinisch inapparenten Phase nach oraler Inokulation von Ziegenlämmern mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: makroskopische, histologische und immunhistologische Befunde im zeitlichen Verlauf

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104969

title (engl.)

Host-pathogen interactions during the clinically inapparent phase after experimental infection of goat kids with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: time-dependent development of macroscopic, histological and immunohistochemical findings

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kruegerc_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Entwicklung der Gewebsläsionen und deren zelluläre Zusammensetzung bei experimentell mit MAP infizierten Ziegen in der klinisch inapparenten Phase zu untersuchen. Dazu erhielten insgesamt 26 Ziegenlämmer beginnend ab dem 11.-20. Lebenstag zehnmal im Abstand von 2-3 Tagen oral 10 mg MAP-Feuchtmasse (Gesamtmenge: 2,6 x 108 CFU). Gruppen von je 6-7 infizierten Tieren und 3 gleichaltrigen Kontrolltieren wurden 3, 6, 9 und 12 Monate nach der Inokulation (Mpi) seziert und Gewebeproben aus dem Darmtrakt, den assoziierten Darmlymphknoten sowie verschiedenen weiteren Organen entnommen. Makroskopische Veränderungen wurden dokumentiert, histologische Befunde in HE-gefärbten Paraffinschnitten erfasst und MAP immunhistologisch und kulturell im Gewebe nachgewiesen. Um die lokale Wirtsreaktion zu charakterisieren, wurden CD4+, CD8+ und γδ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Plasmazellen sowie CD68+, CD25+ und MHC II+ Zellen bei den mit MAP infizierten Ziegen in Läsionen in den granulomatös veränderten jejunalen Peyerschen Platten (JPP) und dem Darmschleimhaut-assoziiertem Lymphgewebe an der Ileocaecalklappe (ICVPP) dargestellt. Zum Vergleich wurden Anzahl und Verteilung der entsprechenden Zellen in unveränderten JPP und ICVPP der Kontrolltiere untersucht.

Die Mehrzahl der Tiere befand sich in der klinisch inapparenten Infektionsphase: 25 der 26 mit MAP inokulierten Ziegen zeigten einen guten bis sehr guten Ernährungszustand und hatten arttypisch geformten Kot. Trotzdem ließen sich bei allen 26 infizierten Tieren histologisch für Paratuberkulose charakteristische granulomatöse Infiltrate nachweisen. Bereits 3 Mpi waren die JPP im proximalen und mittleren Jejunum bei 3 von 7 untersuchten Ziegen infolge des granulomatösen Infiltrates makroskopisch fokal bis diffus verdickt. Histologisch dominierten extensive Infiltrate aus Epitheloidzellen, mehrkernigen Riesenzellen sowie zahlreichen CD4+ und γδ T-Lymphozyten. Ausgedehnte Entzündungszellinfiltrate waren dabei häufig mit Ulzerationen der Tunica mucosa und einer umschriebenen, fibrösen Serositis assoziiert. Immunhistologisch ließen sich nur einzelne MAP nachweisen. Dies spricht dafür, dass die lokale zelluläre Immunreaktion in dieser Infektionsphase in der Lage ist die Vermehrung von MAP zu begrenzen.

Der kulturelle Erregernachweis war im Vergleich zur Immunhistologie die sensitivere Methode, um MAP im Gewebe darzustellen. Die Isolation von MAP aus Tonsillen, Lnn. retropharygei und Lnn. cervicales superficiales bei mehreren Ziegen 3 Mpi deutet daraufhin, dass Tonsillen neben dem Darmtrakt ebenfalls eine bedeutende Eintrittspforte darstellen. Jedoch scheint MAP sich in diesen extraintestinalen Geweben nicht signifikant zu vermehren.

Im weiteren Versuchsverlauf kam es zum Auftreten von Läsionen in den regionalen Darmlymphknoten und der Darmschleimhaut unabhängig vom GALT. Für die Ausbreitung der granulomatösen Infiltrate in der Darmwand spielt möglicherweise die bei mehreren Ziegen 6, 9 und 12 Mpi beobachtete granulomatöse Arteriitis eine Rolle. Bezogen auf Ausdehnung und Schweregrad der Läsionen ließ sich jedoch keine generelle Progression mit zunehmender Infektionsdauer nachweisen. Stattdessen kam es mit zunehmender Infektionsdauer zur Zunahme inter-individueller Unterschiede zwischen den einzelnen Ziegen. Besonders 12 Mpi zeigten sich divergierende Läsionen. So hatten 4 Tiere multifokale Infiltrate aus nur wenigen Epitheloidzellen und mehrkernigen Riesenzellen, in denen sich nur ganz vereinzelt Mykobakterien darstellen ließen. Diese granulomatösen Herde waren bei 3 Tieren begleitet von einer ausgeprägten Infiltration aus überwiegend CD4+ T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Plasmazellen. Diese wurden als starke Immunreaktion interpretiert, die zur lokalen Eliminierung von MAP und zur Begrenzung der Veränderungen führte. Dagegen entwickelten die 3 übrigen Tiere konfluierende bis diffuse Epitheloidzellinfiltrate mit zahlreichen MAP. Lymphozyten waren in diesen Läsionen generell vermindert. Damit scheint die unkontrollierte Erregervermehrung und Ausbreitung der Läsionen mit einer herabgesetzten zellulären und humoralen Immunantwort verbunden zu sein.

Das vorliegende Infektionsmodell erwies sich als geeignet, um die Entwicklung der frühen Veränderungen der Paratuberkulose und deren Einflussfaktoren zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit ließen sich die für die Pathogenese der Paratuberkulose postulierten komplexen zellulären Immunreaktionen in situ, am Ort der initialen MAP-Infektion, im GALT nachvollziehen. Unsere Befunde zeigen, dass wirtsspezifische Faktoren und die individuelle frühe Wirt-Pathogen-Interaktion einen wesentlichen Einfluss auf die Manifestation und Progression der MAP-Infektion haben.

abstract (englisch)

The objective of this investigation was to examine the development of tissue lesions and their cellular composition in goats after experimental infection with MAP. A total of 26 goat kids received 10-times every 2 to 3 days 10 mg bacterial wet weight of MAP (total dose of 2.6 x 108 cfu MAP) beginning at 11 to 20 days of life. Groups of 6-7 infected and 3 age-matched control goats were necropsied at 3, 6, 9 and 12 months post inoculation (mpi), and tissue samples collected from the intestinal tract, regional lymph nodes and additional organs. Macroscopic lesions were documented, histological lesions were evaluated in HE-stained paraffin sections and MAP was detected by immunohistochemistry and by bacterial culture. To characterize the local host reaction, CD4+, CD8+ and γδ T lymphocytes, B lymphocytes, plasma cells, CD68+, CD25+ and MHC II+ cells were labeled in granulomatous lesions in jejunal peyer’s patches (JPP) and mucosa-associated lymphoid tissue at the ileocecal valve (ICVPP) of goats infected with MAP. For comparison, the respective cells were also labeled in JPP and ICVPP without lesions of control goats.

Most goats were in the clinically inapparent phase of paratuberculosis: 25 of the 26 goats inoculated with MAP were in good to very good nutritional condition and passed species-specific formed feces. Nevertheless, granulomatous infiltrates characteristic for paratuberculosis were detected in all 26 infected goats by histology. The macroscopic examination revealed focally to diffusely thickened JPP in the proximal and mid jejunum of 3 of the 7 goats examined as early as 3 mpi. In these animals granulomatous infiltrates consisted predominantly of epitheloid cells, some multinucleated giant cells as well as many CD4+ and γδ T lymphocytes. Severe infiltrates of inflammatory cells were frequently associated with ulcerations of the mucosa and circumscribed fibrous serositis. Only very few MAP were detected by immunohistochemistry. This was interpreted as local immune reaction capable of limiting the proliferation of MAP.

Bacterial culture was more sensitive compared to immunohistochemistry to detect MAP in the tissues. The cultural isolation of MAP from tonsils, retropharyngeal lymph nodes and superficial cervical lymph nodes indicates that tonsils are also important ports of entry besides intestine. There appears to be, however, no significant multiplication of MAP in these extraintestinal tissues.

During the further course of infection, lesions spread to regional intestinal lymph nodes and to intestinal mucosa not associated with GALT. The granulomatous arteritis observed in several goats at 6, 9 and 12 mpi may play an important role in the dissemination of granulomatous infiltrates in the intestinal wall. There was no general progression in the extent and severity of lesions with time post inoculation. Instead, inter-individual differences between the goats became more evident. This divergence of lesions was particularly pronounced at 12 mpi. Four goats had multifocal infiltrates of few epitheloid cells and multinucleated giant cells with single MAP. These small granulomatous foci were surrounded by numerous CD4+ T lymphocytes, B lymphocytes and plasma cells in 3 goats. This type of lesion was interpreted as marked immune reaction that eliminates MAP locally and limits the extent of lesions. In contrast, confluent to diffuse infiltrates of epitheloid cells with many MAP developed in the other 3 goats. The overall number of lymphocytes was reduced in these lesions. The uncontrolled multiplication of MAP and spreading of lesions appears to correlate with a decreased cellular and humoral immune response.

The model of experimental infection of goats was suitable to investigate the development and factors influencing early lesions of paratuberculosis. The results of this investigation allow the reconstruction of the complex cellular immune reactions postulated for the pathogenesis of paratuberculosis in situ, at the site of the initial infection with MAP, in the gut-associated lymphoid tissue. They indicate that host-specific factors and early individual host-pathogen interactions influence manifestation and progression of MAP infection.

keywords

Paratuberkulose, Ziege, Pathogenese, paratuberculosis, goat, pathogenesis

kb

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