Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Andreas Kromik

 

Kausale Charakterisierung der

Bovinen kongenitalen Vertebro-Spinalen Dysplasie in der Holstein-Friesian Population

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105685

title (ger.)

Causal characterization of the bovine congenital vertebral and spinal dysplasia in the Holstein Friesian population

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kromika_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Die bovine kongenitale Vertebro-spinale Dyspalsie (VSD) stellt eine in dieser Arbeit

erstbeschriebene spontane Mutation dar und beschreibt ein Syndrom bei Rindern der

Rasse Holstein Friesian (HF), dessen Phänotyp als besonderes Merkmal entgegen

der seit über 200 Millionen Jahren fixierten 7HR der Säugetiere [249] mit einer Aus-

bildung von nur sechs zervikalen Wirbelkörpern assoziiert ist. Integrierte epidemiolo-

gische Untersuchungen zur VSD konnten eine Reihe von potentiellen umweltbeding-

ten Risikofaktoren ursächlich oder prädisponierend für die VSD ausschließen und

somit eine genetische Basis der VSD bestätigen. Des Weiteren konnte der zu Grun-

de liegende Erbgang als autosomal dominant identifiziert werden, bei welchem der

Phänotyp mit unvollständiger Penetranz und variabler Expressivität ausgeprägt wird.

Der VSD-Phänotyp ist umfassend charakterisiert durch Malformationen und Defekte,

welche die knöcherne Wirbelsäule, aber auch das Rückenmark als Teil des ZNS be-

treffen. Das markanteste, klinisch feststellbare Merkmal ist die Ausprägung einer va-

riablen Brachyurie, welche von kleinsten coccygealen Achsenabweichungen bis zu

deutlichen Knicken sowie stark verkürzten „Korkenzieher“- oder Stummelschwänzen

reicht. Zudem sind unphysiologische Alterationen der hinteren Extremitäten in Hal-

tung, Stellung (steiles Sprunggelenk, Außenrotation der Klauen, Durchtrittigkeit) und

Gang (Spastizität, Ataxie, Paresen, propriozeptive Defizite, „Bunny Hopping“ bei

schnellerer Gangart) in unterschiedlichen Graden charakteristisch, deren Manifesta-

tionsstufen zudem mit denen des Schwanzdefektes korrelieren und sich mit zuneh-

menden Alter sowie Gewicht markanter darstellen. Pathologische Befunde, wie zum

einen fehlende oder zusätzlich ausgebildete Wirbelkörper im zervikalen, thorakalen,

lumbalen und coccygealen Segment, malformierte Schwanzwirbelkörper (Keilwirbel,

fusionierte Wirbel), zusätzlich angelegte, rudimentäre erste Rippen und zum anderen

multiple Defekte vor allem im Bereich des lumbo-sakralen Rückenmarks (Syringo-

Hydromyelie, Hypo- und Dysplasie, Diplomyelie, Duplikation des Zentralkanals) lie-

fern morphologisch-funktionale Erklärungen bezüglich des klinischen Erscheinungs-

bildes des VSD-Phänotypen. Verglichen mit analogen Syndromen anderer Tierarten

weist der VSD-Phänotyp neben dem identischen autosomal dominanten Erbgang

insgesamt starke Analogien zu dem Manx-Syndrom der Katzen auf [11], der eben-

falls auf multiple Mutationen innerhalb des T Gens zurückzuführen ist [13].

Der aus wissenschaftlicher Sicht herausragende Befund ist jedoch die Ausbil-

dung von nur sechs zervikalen Wirbelkörpern, welche als eine homeotische Trans-

formation eines zervikalen Wirbelkörpers C7>T1 zu verstehen ist. So wurden bei drei

der vier Tiere mit nur sechs ausgebildeten Halswirbeln ein zusätzlicher thorakaler

oder lumbaler Wirbelkörper festgestellt. Innerhalb der über 5400 rezenten Säugetier-

arten sind Trichetus, Bradypus und Choloepus die einzigen Genera, welche bekann-

termaßen von der stringenten 7HR abweichen [249]. Diese Tatsache, wie auch die

Ergebnisse einer Studie der humanen Pädiatrie, wobei 83 % der Kinder mit einer

abweichenden Anzahl zervikaler Wirbel starben, bevor sie ein Alter von einem Jahr

erreichten, bestätigen einen hohen natürlichen Selektionsdruck bezüglich dieser 7HR

[248]. Die Vermutung, dass das „brachyury“-Protein einen direkten Einfluss auf die

7HR der Säugetiere hat, konnte nach einer Studie von Pennimpede et al. (2012)

erstmals angenommen werden, nachdem 30 % der Fälle innerhalb eines in vivo

Knockout-Experiments des murinen T Gens eine homeotische Transforma-

tion (C7>T1) ausprägten. Die spontan abgelaufene VSD-Mutation in dem bovinen T

Gen ist unseres Wissens nach der erste Beweis für einen Zusammenhang zwischen

dem T Gen und der 7HR.

Für die Ausprägung des VSD-Phänotypen ist eine nicht-synonyme „nonsense“-

Punktmutation (c.196A>G) in dem Exon 1 des T Gens verantwortlich, welches in der

frühen Entwicklung des Notochords involviert und somit auch relevant für die verteb-

rale und neuronale Modulierung innerhalb der Wirbeltiere ist [49]. Der c.196A>G Po-

lymorphismus hat die Umcodierung eines Basentripletts (AAG → GAG) zur Folge,

welche dann an Stelle der basischen AS Lysin für die saure AS Glutaminsäure auf

Position 66 (p.66Lys>Glu) des „brachyury“-Proteins codiert und nach bioinformati-

schen Analysen eine Änderung der dreidimensionalen Peptidkonfirmation bewirkt.

Als Transkriptionsfaktor bindet das translatierte „brachyury“-Protein als ein Dimer an

die DNS [63], wobei dieser Vorgang nach einem Einbau von Glu66 an Stelle von

Lys66 theoretisch nicht unbeeinflusst bleibt. Kristallographischen Untersuchungen

zufolge bildet das AS Äquivalent zu Lys66 des bovinen „brachyury“-Proteins polare

Interaktionen mit der DNS und ist somit involviert in den DNS-Bindungs-Komplex

[63]. Zudem zeigten „HomoloGene“-Analysen, dass sich die Position 66 des bovinen

„brachyury“-Proteins in einer hoch konservierten Region innerhalb der sog. T-Box

befindet, die sich von den Vertebraten wie Säugetiere (z.B. H. sapiens, M. musculus,

C. lupus, B. Taurus), Geflügel (G. gallus) oder Fischen (D. regio) bis zu den Insekten

(D. melanogaster, A. gambiae) zurückverfolgen lässt und somit ihre evolutionsbiolo-

gische Relevanz innerhalb der Eumetazoa aufzeigt. Zusätzlich konnten durch die

Ableitung des mit VSD-assoziierten HT Pedigree-Analysen durchgeführt werden und

in Verbindung mit der kausalen Mutation (c.196A>G) in dem bovinen T Gen die Mut-

ter des Besamungsbullen FBF0666 (FBF0266) als Founder der kausalen VSD-de

novo-Mutation identifiziert werden.

Als Fazit dieser Arbeit konnte einerseits für grundlegende Forschungsansätze

bezüglich der frühen ontogenetischen Rolle des T Gens in der Entwicklung der AP-

Körperachse innerhalb der Säugetiere ein Beitrag geleistet und andererseits mit der

Identifizierung der de novo-Mutation und des Founders die Relevanz der VSD für die

HF-Population und somit einzelner Individuen auf ein kontrollierbares Maß reduziert

werden.

 

abstract (englisch)

This work provides the first description of the bovine vertebral and spinal dysplasia syn-

drome (VSD), caused by a spontaneous mutation affecting animals of the Holstein Frie-

sian (HF) breed. The striking feature of the VSD phenotype is the development of only

six cervical vertebra which is in contrast to the highly evolutionary conserved mammali-

an seven-vertebra-rule (7HR) fixed for over 200 million years [249]. Initial epidemiologi-

cal analyses revealed that potential environmental risk factors are not causal or predis-

posing for the VSD and confirmed a congenital background of this defect. The mode of

inheritance is autosomal dominant with a variable penetrance and expressivity of the

specific VSD phenotype, which includes malformations and severe defects of the spine

and the spinal cord as a part of the central nervous system. The most concordant clini-

cal observable feature of affected VSD animals is the manifestation of a variable brach-

yury, which ranges from tiniest coccygeal deviations of the norm-axis up to distinct kinks

and severe shortened stumpy or corkscrew-like tails. Furthermore different degrees of

characteristic alterations regarding the hind limb posture (straight hocks, external rota-

tion, hyperextended flexor tendons) and gait (spasticity, ataxia, paresis, proprioceptive

deficits, “bunny-hopping” at increased pace) correlating with the degree of the symptom

brachyury and increasing in expression with the age and higher weight of affected indi-

viduals. Morphologic correlation to neurological malfunctions associated with VSD are

revealed by the pathological results including defects of the spine (lacking or additional

vertebra in the cervical, thoracic, lumbar and coccygeal segment, malformed coccygeal

vertebra (wedge-shaped and fused), additional rudimental first rips) and spinal cord

(multiple defects preferentially localized in between the lumbar and sacral spine like sy-

ringo-hydromyelia, hypo- and dysplasia, diplomyelia, duplication of the central canal). In

comparison with other syndromes of different species, the VSD phenotype exhibits the

autosomal dominant mode of inheritance and also strong analogies to the well-known

manx syndrome described in cats [11] which belongs to multiple feline T gene mutations

[13].

The most outstanding result of the study is the development of only six cervical

vertebras, which can be looked upon as posterior homeotic transformation of the last

cervical vertebra (C7>T1). This is underlined by three of the four affected animals with

six cervical vertebras which showed a surplus thoracic or lumbar vertebra. Within the

over 5400 known mammals, trichetus, bradypus and choloepus are the only genera

which differ from the strict 7HR [249]. Results of a human pediatric study which de-

scribed 83% of the child’s with aberrant numbers of cervical vertebra to have died before

one year of age, confirm a highly selection pressure regarding the 7HR [248]. First

assumptions that the brachyury protein directly influences the 7HR could be made due a

study from Pennimpede et al. (2012) where 30% of the individuals of a murine T gene

knockout experiment expressed a posterior homeotic transformation (C7>T1). To our

knowledge the spontaneous VSD mutation in the bovine T gene shows the first evi-

dence for a link between the T gene and the 7HR.

Responsible for the manifestation of the VSD phenotype is a non-synonymous mu-

tation (c.196A>G) in the first exon of the T gene at BTA9 which is involved in the early

development of the notochord and therefore relevant for the vertebral and neuronal

modulation of the vertebrates [49]. The c.196A>G polymorphism generates a specific

base triplet codon (AAG → GAG) that results in a replacement of the acidic glutamic

acid instead of the alkaline amino acid lysine leading to a change in the three dimen-

sional protein structure illustrated by bioinformatic analysis. As a transcriptional factor

the brachyury protein binds as a dimer to the DNA [63] and it is conceivable that this

binding process is violated by the replacement of Lys66 by Glu66. This is corroborated

by crystallographic investigations showing that the equivalent amino acid to Lys66 forms

polar interactions with the DNA underlining its relevance for the DNA binding complex

[63]. Moreover “HomoloGene” analysis revealed that the position 66 of the bovine

brachyury protein is located in the highly conserved region of the T-box, which can be

traced back from the vertebrates like mammals (e.g. H. sapiens, M. musculus, C. lupus,

B. Taurus), birds (e.g. G. gallus) or fish (e.g. D. regio) up to insects (e.g. D. melano-

gaster, A. gambiae) emphasizing to its evolutionary relevance for eumetazoan species.

Additionally our study identified the mother of the sire FBF0666 as the founder of the

causal de novo mutation (c.196.A>G) via the VSD associated haplotype and resequenc-

ing of the T gene.

The conclusion of this work is that on the on hand a contribution to basic scientific

approaches were achieved regarding the role of the T gene in the early ontogenesis with

developing the anterior-posterior body axis and on the other hand the relevance of the

VSD syndrome for the HF population and consequently single individuals could be re-

duced by identifying the de novo mutation and the founder with the causal characteriza-

tion of this congenital defect.

 

keywords

Erbdefekt, Rind, Brachyurie, congenital defect, cattle, brachyury

kb

4.132