Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Tanja Krimmling

Analysis of porcine precision-cut tissue slices infected by porcine coronaviruses and swine influenza A viruses

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109956

title (deu.)

Analyse der Infektion porziner Gewebepräzisionsschnitte durch porzine Coronaviren und Schweineinfluenza A Viren

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/krimmlingt_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Krankheiten, die im Schwein durch porzine Viren hervorgerufen werden, sind ein wichtiges Thema in der Schweinehaltung. Infektionen des Respirations- und des Gastrointestinaltraktes führen zu hohen wirtschaftlichen Verlusten in der Schweineindustrie und beinhalten ein zoonotisches Potential. Coronaviren und Influenza A Viren sind zwei große Virusgruppen, die in der Schweinepopulation weltweit verbreitet sind. Ein vielversprechendes ex vivo Modell zur Untersuchung von Viren sind Gewebepräzisionsschnitte. Lungenpräszisionsschnitte (PCLS) vom Schwein wurden erfolgreich eingesetzt, um die Infektion mit Schweineinfluenza A Viren zu analysieren. Schweineinfluenza A Viren (SIV) können Teil des Porzinen Respiratorischen Krankheitskomplexes (PRDC) sein. Dieser stellt sich aus verschiedenen respiratorischen Krankheitssymptomen zusammen, welche durch mehrere gleichzeitig vorkommende Pathogene wie Viren und Bakterien ausgelöst werden können. Ein weiteres weit verbreitetes Pathogen im Schwein ist das Porzine Respiratorische Coronavirus (PRCoV). Dieses kommt ebenfalls als Co-Pathogen im PRDC vor. Schweineinfluenzaviren und Coronaviren sind sehr unterschiedliche Virusspezies, die verschiedene Prozesse für den Eintritt und die Fusion mit der Wirtszelle nutzen. Jedoch sind Influenza- sowie Coronaviren umhüllte RNA Viren und eine Interaktion dieser beiden Viren könnte eine Erhöhung ihrer Pathogenität zur Folge haben.

Zur Überprüfung dieser These wurden Präzisionsschnitte der Lunge genutzt, um Mono- und Co-Infektionen mit diesen Viren zu analysieren. PRCoV sowie SIV Subtyp H3N2 oder H1N1 wurden in drei verschiedene Gruppen zur Co-Infektion eingeteilt. Zwei Parameter – die Zilienaktivität und der Virustiter in den Überständen der Lungenschnitte – wurden in mono-infizierten und co-infizierten Schnitten verglichen. Im Gegensatz zur Infektion mit SIV zeigte PRCoV eine geringere Fähigkeit die Zilienaktivität zu reduzieren. Zusätzlich zeigte sich, dass alle Co-Infektionsgruppen sowie die Einzelinfektion der Schnitte mit SIVs dieselbe schnelle Reduzierung der Zilienaktivität hervorgerufen hatte. Die Titer der in den Überständen der Schnitte enthaltenen infektiösen Viren wurden auf zwei verschiedenen Zelltypen – NPTr und MDCKII Zellen – analysiert. Die Titer aller Co-Infektionen waren im Vergleich zu den mono-infizierten Lungenschnitten niedriger oder gleich hoch. Besonders auffällig war die Reduzierung der Coronavirustiter im Überstand der Lungenschnitte durch die kombinierte Infektion mit den Influenzaviren.

Für ergänzende Analysen wurde eine permanente respiratorische Schweinezelllinie genutzt und ebenfalls auf dieselben Kombinationen der Co-Infektion von PRCoV mit SIV H3N2 oder SIV H1N1 getestet. Wiederum zeigten die Ergebnisse keine höheren Titer in den Co-Infektionen, verglichen mit den mono-infizierten Zellen. In diesem Zellkultursystem zeigte sich vor allem eine Reduzierung des Virustiters der Influenzaviren nach kombinierter Infektion mit PRCoV. Sowohl in den Lungenschnitten als auch in dem Zellkultursystem stellte sich eine klare gegenseitige Beeinträchtigung der beiden RNA Viren heraus. Möglicherweise sind nach kombinierter Infektion durch die angeborene Immunantwort der Zellen Interferon Kaskaden ausgelöst worden, welche den Viruseinritt und die Virusvermehrung im Wirt beeinträchtigen. Weitere Untersuchungen von Lungenschnitten könnten helfen, die Mechanismen der Restriktion der Viren durch die Zellen zu erklären.

Zusätzlich zu den Lungenschnitten wurden Darmschnitte etabliert, um deren Infektion mit dem Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) zu untersuchen. TGEV infiziert die Epithelzellen auf den Zottenspitzen des Jejunums. Diese Infektion verursacht eine wässrige Diarrhoe, die bei Ferkeln zu schweren Krankheitsverläufen bis hin zum Tod durch Dehydrierung führt. Nach wie vor ist die Herstellung permanenter Darmepithelzelllinien und ihre Erhaltung in Kultur schwierig. In der vorliegenden Arbeit wurden porzine Darmpräzisionsschnitte etabliert, um die Analyse von Darminfektionen mit TGEV zu ermöglichen. Die Darmschnitte wurden auf ihre Vitalität mittels Messung der ATP Freisetzung analysiert und zeigten in einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung ein intaktes Epithel über einen Inkubationszeitraum von bis zu 24 h. Zur Infektion der Darmpräzisionsschnitte wurden drei verschiedene TGEV Stämme genutzt. TGEV PUR 46-MAD ist ein viel genutzter Laborstamm, der bekannt dafür ist, in seiner Pathogenität abgeschwächt zu sein. Der Stamm TGEV Miller wurde in Ferkeln subkultiviert, um eine erhöhte Infektiosität im Tier zu erreichen. Bei dem dritten Stamm, TGEV GFP, handelt es sich um ein rekombinantes Virus, dessen Hauptgenom von TGEV PUR 46-MAD stammt. Jedoch wurde das Gen, welches für das Spike Protein kodiert, dem Stamm TGEV PUR-C11 entnommen, welcher eine erhöhte Mortalitätsrate im Schwein aufweist. Die Ergebnisse in den Darmschnitten stimmen mit diesen Aussagen zur Enteropathogenität überein. Sowohl TGEV Miller als auch TGEV GFP waren fähig die Darmepithelzellen zu infizieren. Wohingegen für TGEV PUR 46-MAD kein Nukleokapsidprotein in den Epithelzellen nachgewiesen werden konnte. Dies zeigt, dass das Potential zur Infektion des Darms durch die TGEV Stämme vom Spike Protein determiniert wird.

Insgesamt zeigen die Analyseergebnisse in Lungen- sowie Darmpräzisionsschnitten Übereinstimmungen zu in vivo Versuchen auf. Ihre Nutzung als Organmodell für Infektionsstudien kann weitere Einsichten in die Mechanismen von Virusinfektionen bewirken und gleichzeitig die Anzahl von Tierversuchen verringern.

abstract (englisch)

Porcine diseases provoked by viruses are a main issue in swine farming. Infections of the respiratory as well as gastrointestinal tract can lead to high economic loss in pig industry, but may also include a zoonotic potential. Coronaviruses as well as influenza A viruses are two groups of viruses that are widely spread though swine populations all over the world. A promising ex vivo model that can give insight into swine diseases, are precision-cut tissue slices. For porcine lung, precision cut-lung slices have been successfully used to analyze swine influenza A infections (SIV). The influenza viruses are known to play a major role in the porcine respiratory disease complex (PRDC). PRDC describes a combination of respiratory disease symptoms that are caused by an infection with different pathogens like viruses and bacteria. Another respiratory pathogen in swine is the porcine respiratory coronavirus (PRCoV), which is commonly present in swine population. PRCoV is also assumed to be part of the PRDC. Swine influenza viruses and porcine respiratory coronaviruses use different pathways for cell entry and fusion with the host cell. However, coronaviruses as well as SIVs are both enveloped single-stranded RNA viruses and an interaction and therefore increase in pathogenicity is possible.

To find out if interplay between these viruses has an impact on disease outcome an infection with both viruses in porcine tissue was analyzed. SIV subtypes H3N2 and H1N1 were used to analyze the co-infection with PRCoV in porcine PCLS. Three different combinations for co-infections were used. Two parameters – ciliary activity and virus titer of PCLS supernatants – were compared in mono- and co-infection of the slices with the coronavirus and SIVs. In contrast to SIV, infection with PRCoV revealed a low impact on ciliary activity. No differences in ciliary activity were measured between the SIV mono-infections and viral co-infections. The virus titer in the PCLS supernatant was analyzed on two different cell types – NPTr and MDCKII cells. Surprisingly, the titer of all co-infection groups was either lower or at the same level as the mono-infections of the PCLS. On NPTr cells, the supernatant of the slices revealed a decrease in infectious PRCoV when co-infected with either SIV H3N2 or SIV H1N1.

In addition to the PCLS model, a porcine respiratory cell line was used to analyze the co-infection of PRCoV and SIV H3N2 or SIV H1N1. Again no increase of virus titers of the co-infection groups with SIV H3N2 or SIV H1N1 was measurable compared to mono-infection with PRCoV or SIVs. In this system the decrease in SIV H3N2 and SIV H1N1 titers when co-infected in cells with PRCoV was most obvious. Interference between both RNA virus species could influence the outcome of infectious virus. The activated cell innate immune system might have induced interferon cascades that restrict the virus entry and replication inside the cell. Further investigation on PCLS co-infections is needed to clarify the mechanisms that cause cell restriction to viruses in the tissue.

Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) is another important coronavirus in swine farming. TGEV causes lethal watery diarrhea in piglets by infection of epithelial cells on the tip of jejunal villi. However, permanent intestinal cell lines are rare and maintenance is difficult. Therefore, porcine precision-cut intestinal slices (PCIS) were established in this work to analyze intestinal virus infection with TGEV. PCIS were tested for vitality by ATP measurement and showed an intact epithelial cell layer up to 24 h. PCIS were infected by three different TGEV strains. TGEV PUR 46-MAD is a commonly used TGEV strain that is known to be attenuated. TGEV Miller is passaged in piglets several times to reveal high infection. Finally, TGEV GFP is a recombinant strain that obtained its genome from TGEV PUR 46-MAD, except its spike protein gene that derived from TGEV PUR-C11- a virus strain with high mortality in piglets in vivo. Our results were in complete consensus of these statements. TGEV Miller and TGEV GFP were able to infect the jejunal epithelial cells in the tissue slices. However, for TGEV PUR 46-MAD no nucleocapsid protein was detected in the epithelial cells of PCIS. This demonstrates that differences in TGEV strains and their infectious potential are highly dependent on their S protein.

In conclusion, the analyses in PCLS as well as PCIS accorded to infection studies done in vivo and represent therefore an advantageous model to investigate virus infections without the use of animal experiments.

keywords

Gewebepräzisionsschnitte, Coronaviren, Schweineinfluenza ; Precision- cut tissue slices, coronavirus, SIV

kb

1.603