Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Robert Kreutzer

 

Molecular pathogenesis, differential transcription of enzymes forming the lysosomal multienzymic complex

and microsatellite based genotyping in canine GM1-gangliosidosis

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-96300

title (ger.)

Molekulare Pathogenese, differentielle Expression der Enzymen die den lysosomalen multienzymatischen Komplex bilden und Mikrosatelliten basierte Genotypisierung der kaninen GM1-Gangliosidose

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2008

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kreutzerr_ws08.pdf

abstract (deutsch)

Die GM1-Gangliosidose ist eine autosomal-rezessive lysosomale Speicherkrankheit deren Ursache ein Verlust der ß-Galaktosidase Aktivität ist. Die Ursache dieser angeborenen Erkrankung liegt in einem genetischen Defekt innerhalb des kaninen sauren ß-Galaktosidase Gens (GLB1). Aufgrund  spezifischer biochemischer Parameter und dem Alter  bei dem die  ersten Ausfallserscheinungen auftreten wurde die humane  GM1-Gangliosidose in 3 Typen eingeteilt. Die bei Alaskan Huskies vorkommende GM1-Gangliosidose ähnelt dem humanen Typ 2 und wird durch eine 19 Basenpaare (bp) Duplikation im Exon 15 der GLB1 (c.1688_1706dup19) hervorgerufen. Der genetische Defekt übt eine Doppelrolle  durch eine Leserasterverschiebung sowie durch die Beeinflussung des prä-mRNA Spleißens aus. Dadurch entstehen zwei abnormale GLB1 mRNA-Isoformen die anschließend in defekte verkürzte Proteine translatiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die mRNA Expression der  GLB1 und anderer wichtiger Komponenten des lysosomalen multienzymatischen Komplexes (Neuraminidase 1 und das Protective Protein/Cathepsin A) sowie der intrazelluläre Transport und die Prozessierung des GLB1-Proteins untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigten eine Genotyp-abhängige Regulierung der GLB1- und der Protective Protein/Cathepsin A-Expression in GLB1+/- und  GLB1-/-  im Vergleich zum Wildtyp GLB1+/+. Die durchgeführten Studien zeigten auch eine signifikante Erhöhung der PPCA- Menge im Zusammenhang mit der Anzahl abnormaler GLB1-Allele (eins in GLB1+/- und zwei in GLB1-/-), wohingegen die Neuraminidase 1 Aktivität Genotyp-unabhängig im physiologischen Rahmen blieb. Des Weiteren, wurde die intrazelluläre Lokalisation, die Prozessierung, sowie die enzymatische Aktivität der mutanten GLB1 untersucht. Die abnormalen Vorläuferproteine erwiesen sich als enzymatisch inaktiv, wurden aber ähnlich dem Wildtyp GLB1 in die Lysosomen transportiert. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass die kodierte  Aminosäurensequenz von Exon 15 und 16 für die korrekte Prozessierung und die Entfaltung der enzymatischen Aktivität notwendig ist, wohingegen der Transport zu den Lysosomen durch den genetischen Defekt nicht beeinflusst wurde.

In Folge des autosomal-rezessiven Erbganges der GM1-Gangliosidose, zeigen die heterozygoten Anlageträger einen  Wildtyp-Phänotyp und tragen dadurch zur Verbreitung des mutanten Allels in der Hundenpopulation bei. Daher ist die Etablierung von neuartigen genetischen Testmethoden, welche auch die phänotypisch Gesunden heterozygoten Anlageträger erfassen, äußerst wichtig. Zu diesem Zweck  wurde in der vorliegenden Arbeit ein verlässliches Genotypisierungsinstrument für die kanine GM1-Gangliosidose, welches in Vaterschaftstests eingebunden werden kann, entwickelt. Dafür wurde die Assoziation zwischen der kaninen GLB1 und dem Mikrosatelliten AHT K253 in 30 Alaskan Huskies (11 GLB1+/+, 17 GLB1+/- and 2 GLB1-/-) untersucht. Das 143 bp lange Mikrosatellitenallel wurde ausschließlich  in GLB1+/-- und GLB1-/-- Individuen nachgewiesen und steht in einem starken Kopplungsungleichgewicht mit der  19 bp Duplikation im Exon 15 der kaninen GLB1.  Die mittels Mikrosatelliten-Analyse erzielten Ergebnisse zeigten eine 100%ige Übereinstimmung mit den bestimmten GLB1 - Genotypen. Der Mikrosatellit AHT K253, welcher routinemäßig in Vaterschaftstests eingesetzt wird, hat somit einen hohen prädiktiven Wert für die Identifikation der kaninen Anlageträger.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die untersuchte  Erbkrankheit beim Alaskan Husky ein geeignetes Tiermodel für die spät-infantile Form der humanen GM1-Gangliosidose ist und ein vielseitiges System für die Überprüfung gentherapeutischer Vorgehensweisen zur Heilung von lysosomalen Speicherkrankheiten bei Mensch und Hund darstellt.

 

abstract (englisch)

GM1-gangliosidosis is an autosomal-recessive lysosomal storage disorder caused by a deficiency of the ß-galactosidase activity, due to genetic defects affecting the GLB1. Human GM1-gangliosidosis has been classified into 3 forms according to the age at clinical onset and specific biochemical parameters. In Alaskan huskies the GM1-gangliosidosis resembles the human type II form and is caused by 19bp duplication in the exon 15 of the GLB1 (c.1688_1706dup19). This genetic defect exerts a dual role generating a frame shift and inducing an abnormal splicing of GLB1 precursor mRNA. Therefore, two mutant GLB1 mRNAs are generated and subsequently translated in truncated GLB1 proteins. In the present work the investigations focused on the analysis of the mRNA expression of GLB1, NEU1 and PPCA LMC components, as well as on the analysis of the intracellular trafficking and post-translational processing of GLB1.  The obtained results showed a differential regulation of GLB1 and PPCA in GLB1+/- and GLB1-/- , compared to the wild type genotype (GLB1+/+). In addition, it was shown that PPCA protein levels gradually increased with the number of the expressed mutant GLB1 alleles (one in GLB1+/- and two in the GLB1-/-), while the NEU1 activity remained in the normal range in all genotypes. Further, the intracellular localization, processing and enzymatic activity of the mutant GLB1 proteins was investigated and it was shown that mutant protein precursors and mature proteins are enzymatically inactive. Surprisingly, these mutant proteins are transported to lysosomes like the wild type GLB1. The obtained results indicate that the amino acid sequences encoded by exons 15 and 16 are necessary for correct processing and enzymatic activity, whereas the routing to the lysosomes is not influenced by the genetic defect.

As mentioned, due to the autosomal-recessive character of the GM1-gangliosidosis the heterozygous carriers are phenotypical normal and contribute to the spread of the mutant allele into the canine population. Therefore, besides elucidating the pathogenesis of this disease, establishing of novel genetic tests is crucial. In the present work, a reliable tool for genotyping the canine GLB1 that can be effectively integrated in parentage testing investigations was designed. For this purpose the association between the GLB1 gene and the AHT K253 microsatellite was analyzed in 30 Alaskan huskies (11 GLB1+/+, 17 GLB1+/- and 2 GLB1-/-dogs). The 143 bp AHT K253 microsatellite allele was identified only in GLB1+/- and GLB1-/- animals and displayed strong linkage disequilibrium with the causative mutation for GM1-gangliosidosis, the 19 bp duplication within exon 15 of the GLB1. The results of this study revealed a 100% concordance between the previous established genotypes and those obtained after the analysis of the AHT K253 microsatellite. Therefore, the genotype of the AHT K253 microsatellite, which is routinely determined during dog parentage testing, has a high predictive value for identifying the GM1-gangliosidosis carrier status.

Summarized, the investigated inherited disease is an appropriate animal model for the human late infantile GM1‑gangliosidosis form and represents a versatile system to test gene therapeutic approaches for cure of both the human and canine disease.

 

keywords

GM1-Gangliosidosis, Pathogenesis, Genotyping; GM1-Gangliosidose, Pathogenese, Genotypisierung

 

kb

4.376