Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Julia Korrell

Charakterisierung von Legumainen des bovinen Lungenwurmes und deren Evaluierung als Vakzinekandidaten

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104931

title (engl.)

Characterization of two legumains of the bovine lungworm and their evaluation as vaccine targets

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/korrellj_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Der Rinderlungenwurm Dictyocaulus viviparus verursacht bei Rindern eine antikörpermediierte, protektive Immunität, die mehrere Monate anhält. Daher erscheint es möglich, eine rekombinante Subunitvakzine zur Prophylaxe dieser Parasitose entwickeln zu können. Ziel dieser Arbeit war die in vitro Charakterisierung der beiden Asparaginylpeptidasen Legumain-1 (LEG-1) und Legumain-2 (LEG-2) und die Evaluierung ihres protektiven Potentials in Vakzineversuchen. LEG-1 und LEG-2 wurden rekombinant in der Hefe P. pastoris exprimiert und zeigten sich in vitro funktionell aktiv. Transkriptionsmuster der Legumaine im Verlaufe des Entwicklungszyklus des Parasiten wurden mittels quantitativer real-time PCR (qPCR) erstellt und ergaben eine fast ausschließliche Transkription in den parasitischen Lungenwurmstadien. Diese Ergebnisse wurden mittels Western Blot auf Expressionsebene verifiziert und deuten auf eine Parasitismus-assoziierte Funktion der Enzyme hin. Immunfluoreszenzfärbung von Schnitten adulter Weibchen detektierte beide Legumaine im Darm des Parasiten, was auf eine Funktion im Rahmen der Digestion hindeutet. Eine phylo­genetische Analyse der beiden Legumaine von D. viviparus und 28 anderer Spezies ordnete alle Taxa erwartungsgemäß in ihren Stämmen und Familien an. Schließlich erfolgte die Evaluierung der beiden Vakzinekandidaten im in vivo Impfversuch. Rekombinantes LEG‑1 und LEG-2 mit Matrix Q™ (ISCONOVA AB) als Adjuvans wurden in zwei separaten Vakzineversuchen getestet. Im dritten Vakzineversuch wurden Kälber mit einer Kombination aus beiden Legumainen und dem Adjuvans QuilA™ (GERBU) geimpft. Trotz erfolgter Serokonversion in den Antikörperklassen IgG, IgG1 und IgG2 bei den LEG-1-geimpften Tieren konnte keine Reduktion der Wurmbürde oder der Larvenausscheidung erreicht werden. Während die Würmer der geimpften Tiere dieses ersten Vakzineversuches signifikant länger als die der dazugehörigen Kontrolle waren, zeigten sich die weiblichen Würmer der mit LEG-2 und Matrix Q™ geimpften Tiere im zweiten Vakzineversuch signifikant kürzer als die der Kontrollgruppe. Die Würmer der mit einer Kombination aus LEG-1 und LEG-2 geimpften Tiere im dritten Vakzineversuch waren ebenfalls signifikant kürzer als die der dazugehörigen Kontrollgruppe. Zudem erfolgte im zweiten und dritten Vakzineversuch zusätzlich eine IgA-Serokonversion. Die geimpften Tiere des dritten Vakzineversuches zeigten signifikant höhere Gewichtszunahmen als die Kontrollgruppe, was auf eine synergistische Wirkung der LEG-1- und LEG-2-Blockierung hinweisen könnte. Die im Zuge der Legumain-Lokalisation im Parasitendarm aufgestellte Hypothese, dass es sich bei den beiden Legumainen um hidden antigens handelt, die natürlicherweise nicht mit dem Immunsystem des Wirtes in Berührung kommen, wurde durch die ELISA-Ergebnisse der Vakzineversuche bestätigt. Die in den drei Vakzineversuchen ausgebliebene Protektion ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die alleinige Ausschaltung eines oder zweier Enzyme für die Bekämpfung komplexer, eukaryoter Organismen wie D. viviparus nicht ausreichend ist. Vielleicht könnte durch die Kombination mehrerer Cysteinproteasen eine synergistische Wirkung erzielt und somit die gewünschte Protektion hervorgerufen werden.

abstract (englisch)

The cattle lungworm Dictyocaulus viviparus evokes an antibody-dependant protective immune response in the cattle host that lasts several months. It would thus appear possible to develop a recombinant vaccine for prophylaxis of parasitic bronchitis. This study aimed to characterize the asparaginyl peptidases legumain-1 (LEG-1) and legumain-2 (LEG-2) of D. viviparus in vitro and to analyze their protective potential as recombinant subunit vaccine candidates. LEG-1 and LEG-2 were recombinantly expressed in the yeast Pichia pastoris and subsequently analyzed in fluorescent enzyme activity assays concerning their in vitro functionality. Both enzymes needed trans-activation through a cathepsin to be functionally active. Transcription patterns of LEG-1 and LEG-2 throughout the parasite´s life cycle were evaluated via quantitative real-time PCR (qPCR) and showed almost exclusive transcription in parasitic lungworm stages. The results were verified on expression level by western blotting and indicate parasitism-associated functions. Immunofluorescence staining revealed LEG-1 and LEG-2 in cells of the intestine of adult worms, which implies a participation in digestion processes. Additionally, phylogenetic classification of D. viviparus LEG-1 amongst 28 legumains of various species was performed and confirmed a close relationship between nematode legumains. To evaluate the protective potential of the candidate proteins, three in vivo vaccination trials were carried out. Recombinant LEG-1 and LEG-2 with Matrix Q™ (ISCONOVA AB) as adjuvant were tested in two separate trials. In a third trial a combination of both legumains and QuilA™ (GERBU) as adjuvant were ad­ministered. Statistically significant reductions in larvae shedding or worm burden were not achieved in any of the three trials. A seroconversion of IgG-, IgG1- and IgG2- antibodies was observed for LEG-1 vaccinated cattle in the first trial, while in the second and third trial an additional IgA-seroconversion occurred. Unusually, worms of LEG-1 vaccinated cattle were significantly longer than those of the control group, whereas significantly shorter worms resulted from LEG-2- as well as combined LEG-1/LEG-2- vaccinated animals. Furthermore, cattle of the vaccinated group of the third trial showed significantly enhanced weight gain, probably caused by a synergistic effect. Results of their in vitro characterization, their transcription pattern and their immunelocalization enhance the presumption that legumains participate in the nutrition of D. viviparus. The assumption that legumains are hidden antigens, which was based on their localization in the parasite´s gut was confirmed by ELISA-experiments during the vaccination trials. The lacking protection in all three vaccination trials might be caused by the fact that nematodes are complex organisms and that blocking of just one or two enzymes is not sufficient for control. A combination of several cysteine proteases may have synergistic effects and thus protect against D. viviparus.

keywords

Dictyocaulus, Legumain, Vakzine, Dictyocaulus, legumain, vaccine 

kb

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