Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Franziska Koop

Untersuchungen zur Bedeutung der Mischfutterstruktur bei experimenteller Infektion von Absetzferkeln

mit Salmonella Derby bzw. mit Streptococcus suis

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104057

title (engl.)

Investigations regarding the effect of diet’s physical form on experimental infection with Salmonella Derby or Streptococcus suis in weaned piglets

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/koopf_ws13.pdf

abstract (deutsch)

In der vorliegenden Untersuchung sollten die Auswirkungen einer unterschiedlichen Futterstruktur auf die Ausscheidung von S. Derby unter den Bedingungen einer experimentellen Infektion von Absetzferkeln untersucht werden. Des Weiteren war die Möglichkeit einer oralen Infektion von Absetzferkeln mit Sc. suis und ihre mögliche Beeinflussung durch die Fütterung von besonderem Interesse.

Zu diesem Zweck wurden in einem ersten Versuchsabschnitt 40 männlich-kastrierte Absetzferkel auf 4 Gruppen (mit je 10 Tieren) verteilt. Die 4 verwendeten Mischfuttermittel, (Basis: Weizen, Gerste und Sojaextraktionsschrot), waren botanisch und chemisch identisch, unterschieden sich jedoch hinsichtlich ihrer Struktur in Form von Vermahlung und Konfektionierung:

 

MF-Variante   Vermahlung    Konfektionierung       GMD [µm]1

Pellet fein       Hammermühle  Pellet                                    256

Schrot grob     Walzenstuhl    Schrot                                     466

Pellet grob      Walzenstuhl    Pellet                                      442

Expandat grob Walzenstuhl   Expandat                                276

 

1Geometric Mean Diameter modifziert nach WOLF et al. 2012

 

Nach einer 12 tägigen Adaptation wurde ausschließlich die jeweilige MF-Variante angeboten. Nach einer Woche wurden 2 Tiere (= „Seeder“) aus jeder Gruppe separiert, oral mit ~ 10^9 KBE S. Derby infiziert und nach kulturellem Erregernachweis im Kot wieder zurück in die jeweilige Gruppe gestallt. Über die anschließenden 4 Wochen erfolgten regelmäßig (Tag 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28 nach Rückkehr der Seeder in die Gruppe) kulturell-qualitative Untersuchungen von Rektaltupfern auf Salmonellen (nach Anreicherung und Ausstrich auf Selektivnährböden), um die Ausscheidung der Salmonellen beurteilen zu können. In der Sektion am Versuchsende wurden Zäkumchymus und der Ln. ileocaecalis ebenfalls kulturell qualitativ auf S. Derby untersucht, außerdem erfolgte eine Untersuchung von Blutproben auf Antikörper gegen das LPS der Salmonellen mittels ELISA.

In einem zweiten Versuch wurden 27 Absetzferkel (männlich, kastriert) in 3 Gruppen von je 9 Tieren aufgeteilt. In allen Gruppen kam ein kommerzielles Aufzuchtfutter zum Einsatz. Jedes Tier einer Gruppe wurde nach einer Adaptation von 15 Tagen mit dem Sc.-suis-Serotyp-2-Stamm 10, die Tiere einer zweiten Gruppe mit dem Serotyp-9-Stamm A3286/94 oral mit einer Infektionsdosis von ~ 10^10 KBE belastet.

Die dritte Gruppe diente als Negativkontrolle. In der auf die orale Belastung folgenden Zeit wurde mehrmals täglich das Allgemeinbefinden der Tiere (Lahmheiten, ZNS-Störungen, erschwerte Atmung, Futteraufnahme) überprüft.

Regelmäßig wurden Blutproben für die serologische Untersuchung mittels ELISA auf IgG-Antikörper gegen das MRP von Sc. suis entnommen. An den Tagen 5, 8, 11 und 15 p.inf. fanden die Sektionen der Tiere statt. Es folgten kulturelle sowie pathohistologische Untersuchungen innerer Organe, die bei einer Sc.-suis-Infektion häufig Veränderungen aufweisen (Gehirn, Leber, Milz, Lunge etc.) sowie der darmassoziierten Lymphknoten. Eine Differenzierung der kulturell nachgewiesenen a-hämolysierenden Streptokokken erfolgte mit einer MP-PCR, in der die spezifischen Genprofile der eingesetzten Stämme nachgewiesen wurden. In nachgeschalteten In-vitro-Untersuchungen wurde dann der Einfluss der im Mischfutter enthaltenen antibakteriellen Futterzusatzstoffe (Ameisensäure, Milchsäure, Kupfer) auf das Überleben von S. Derby und Sc. suis im Futter überprüft. Weiterhin wurde in einem Ex-vivo-Versuch der spezifische Einfluss der Futterstruktur auf das Überleben von S. Derby und auch Sc. suis im Mageninhalt von Absetzferkeln untersucht. Dabei stammte der Mageninhalt aus der Fundusregion des Magens von Ferkeln, die als Mischfutter entweder ein grobes Schrot oder ein feines Pellet erhielten.

 

Es ergaben sich hierbei folgende Ergebnisse:

 

Einfluss der Futterstruktur auf S. Derby beim Schwein in/ex vivo

            -           Im Infektionsversuch konnte gezeigt werden, dass die Seeder unabhängig von

                        der MF-Variante den Erreger ausschieden (zum Teil intermittierend). In der

                        Sektion war der Erreger immer auch im Zäkumchymus der Seeder

                        nachweisbar, ein Nachweis der Translokation in den Ileozäkallymphknoten

                        erfolgte in jeder Fütterungsgruppe, aber nicht bei jedem Tier.        

            -           Eine Ausscheidung des Erregers durch die Kontakttiere war in allen Gruppen

                        unabhängig von der Struktur des MF eher selten, sodass keine statistisch

                        signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnten. Auch im

                        Zäkumchymus der Kontakttiere war der Erreger in der Sektion nur selten

                        nachzuweisen (PF:1; SG:0; PG:1; EG:0 von 8 Tieren). Eine Translokation in

                        den Darmlymphknoten war auch nur bei einem Kontakttier (PF) nachweisbar.

            -           Ex vivo war ein sehr deutlicher Enfluss der Futterstruktur auf das Überleben

                        von S. Derby zu beobachten: Während im Mageninhalt nach Aufnahme feiner

                        Pellets (pH = 5,09 ± 0,105; n = 5) sogar noch eine Vermehrung der Erreger

                        stattfand, kam es im Chymus der MF-Variante Schrot grob (pH = 2,48 ± 0,024;

                        n = 5) zu einem raschen Absterben (nach 240 min: 268±132 vs. 0,0±0,000 %

                        der Erreger noch nachweisbar).

 

Einfluss von Ameisensäure, Milchsäure bzw. Kupfer auf S. Derby/Sc. suis in vitro

 

            -           In dem Mischfutter mit den genannten antibakteriell wirksamen Zusatzstoffen

                        konnten nach 120 min noch 58,5 % der ursprünglich zugesetzten Dosis von

                        S. Derby nachgewiesen werden. Die eingesetzten Sc.-suis-Stämme waren zu

                        diesem Zeitpunk schon fast vollständig eliminiert (Stamm 10: 0 %; A3286/94: 0,001 %)

            -           Bei Untersuchungen im Nährmedium war der antibakterielle Effekt der

                        Ameisensäure gegenüber Sc. suis besonders deutlich (0,352 %

                        Ameisensäure in THB: Nach 1 h keiner der beiden Stämme mehr

                        nachweisbar). Dieser Effekt nahm mit fallender Konzentration der Säure ab.

                        Für Milchsäure (max. 0,067 %) und Kupfer (max. 150 mg/kg) war in den

                        verwendeten Konzentrationen kein Effekt auf die beiden Sc.-suis-Stämme zu beobachten.

 

Möglichkeit/Beeinflussung einer oro-gastro-intestinalen Infektion mit Sc. suis in/ex vivo

 

            -           Im Infektionsversuch mit Sc. suis konnte der Serotyp-9-Stamm A3286/94 nur

                        in einem einzigen Tier (Tonsille!) reisoliert werden, ansonsten war bei keinem

                        Tier der applizierte Erreger nachweisbar. Die bei einigen Tieren beobachteten

                        klinischen Störungen (Fieber, Apathie) waren also, ebenso wie

                        pathohistologische Veränderungen, nicht mit einem Erregernachweis

                        verbunden und kamen zudem genauso in der Kontrollgruppe vor.

            -           Eine oro-gastro-intestinale Infektion von Absetzferkeln mit den verwendeten

                        Stämmen von Sc. suis war unter den gegebenen Versuchsbedingungen bei

                        keinem einzigen Absetzferkel nachweisbar.

            -           Im nachgeschalteten Ex-vivo-Versuch konnte keiner der verwendeten Sc.-

                        suis-Stämme auch bei den relativ hohen pH-Werten im Magen (4,71±0,227)

                        nach Einsatz des feinen pelletierten MF nach 30 min nachgewiesen werden.

 

In dieser Arbeit zeigten sich signifikante Unterschiede im Überleben zwischen S. Derby und Sc. suis im Mageninhalt ex vivo. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit einer Adaptation der Salmonellen an eine oro-gastro-intestinale Infektionsroute. Die hocheffiziente Elimination von Sc. suis im Mageninhalt ex vivo verdeutlicht die wichtige bakterizide Funktion der Magenbarriere und spricht grundsätzlich gegen die postulierte oro-gastro-intestinale Infektionsroute von Sc. suis bei Absetzferkeln.

Bei einer gröberen Struktur des Mischfutters kann die Zahl zoonotisch bedeutsamer Salmonellen, die auf oralem Wege in den Wirt eindringen, über eine effizientere Magenbarriere (Fundus!) wesentlich reduziert werden. Eine Rücknahme der Vermahlungsintensität bei der MF-Herstellung hat demnach auch eine infektionsmedizinische Bedeutung. Durch den Einsatz eines groben Schrotes als Mischfutter kann also ein wesentlicher Beitrag zur Förderung der Gesundheit junger Schweine in der Flat-Deck-Phase geleistet werden.

 

abstract (englisch)

This study aimed to investigate the effects of feed structure on faecal shedding of S. Derby after experimental infection of weaned piglets. Furthermore, a presumed oral infection route of Sc. suis in weaned piglets and consecuting possible influences of feed structure should be evaluated.

In a first trial, 40 weaned piglets (male, castrated) were divided into 4 feeding groups (10 animals each). The 4 diets used (based on wheat, barley and soybean meal) were botanically and chemically identical, and differed only in grinding type/intensity and type of compaction:

 

feed                            mill type          compaction     GMD [µm]1

fine pellet (FP)           hammer mill    pellet               256

coarse meal (CM)       roller mill        meal                466

coarse pellet (CP)       roller mill        pellet               442

coarse expandate (CE) roller mill      expandate       276

 

1 Geometric Mean Diameter as modified by WOLF et al. 2012

 

After an adaption period of 12 days, each group was fed the specific diet exclusively.

One week later, 2 animals of each group (=”seeder”) were separated and orally infected with ~ 10^9 CFU S. Derby. They returned into the group after cultural proof of pathogen in rectal swabs. During the following investigation period of 4 weeks, rectal swabs were examined for their Salmonella-load culturally (day 1, 3, 5, 7, 14, 21 and 28 after return of the seeders into the group) in order to judge the shedding rate.

Dissection marked the end of the trial. Caecal chyme and the ileocaecal lymph node were examined culturally for S. Derby. Blood samples were taken and analyzed for antibodies against the LPS of Salmonella.

In a second trial, 27 weaned piglets (male, castrated) were divided into 3 groups of 9 animals. All groups were fed a commercial starter diet. After an adaptation period of 15 days, each animal of one group was orally burdened with ~ 10^10 CFU of Sc- suisserotype 2 (strain 10). All animals of a second group received equal amounts of Sc.-suis-serotype 9 (strain A3286/94), while the animals of the third group served as a negative control. Examinations of the piglets searching for signs of lameness, centralnervous disorders, impaired respiration or feed intake were carried out several times a day in the consecutive investigation period. Furthermore, blood samples were taken regularly and analized serologically for their content of IgG against the MRP of Sc. suis by ELISA. Dissection of the animals took place at day 5, 8, 11 and 15 after infection. Cultural and pathohistological examinations of inner organs (brain, liver, spleen, lung etc.) as well as intestinal lymph nodes (Ln. jejunales, ileocaecales, colici) were carried out. An MP-PCR was used to differentiate a-haemolytic streptococci found in cultural examination by genotyping the isolates.

During the following in-vitro-investigations, the effects of antimicrobial feed additives (formic acid, lactic acid, copper) on S. Derby and Sc. suis in feed and culture media were investigated. Furthermore, the specific influence of stomach content on survival of the named bacteria was examined in an ex vivo-trial. The used stomach content originated of the gastric fundus region of weaned piglets, which were fed either a coarse meal or a fine pellet.

 

The following results were observed:

 

Influence of feed structure on S. Derby in pigs in/ex vivo

 

            -           The in vivo investigations showed (partly intermittent) shedding of the

                        pathogen by seeder-animals regardless of the feed structure. At dissection

                        S. Derby could be found in caecal chyme of all seeder animals, a proof of

                        pathogen in the ileocaecal lymph node was possible in every feeding group,

                        but not in every animal.

            -           Shedding of the pathogen by contact animals was rather rare in all groups.

                        Due to that effect, no significant differences between the groups were

                        observed. Only few contact animals showed a proof of S. Derby in caecal          

                        chyme (FP:1; CM:0; CP:1; CE:0 of 8 animals). A translocation of the pathogen

                        into the ileocaecal lymph node was detected in only one animal (FP)

            -           Ex vivo a strong effect of feed structure could be observed. While a

                        multiplication of pathogen counts was seen in stomach content of the feeding

                        group FP (pH = 5.09 ± 0.105; n = 5), stomach content of the group CM

                        (pH = 2.48 ± 0.024; n = 5) had a rapid reducing effect on S. Derby (240 min

                        after inoculation: 268±132 vs. 0.0±0.0 % of bacteria still detectable).

 

Influence of fumaric acid, lactic acid or copper on S. Derby/Sc. suis in vitro

 

            -           A compound feed supplemented with the named additives caused a reduction

                        down to 58.5 % of the initial dose of S. Derby after 120 min. The Sc.-suisstrains

                        used were almost eliminated at that point of time (strain 10: 0 %; A3286/94: 0.001 %).

            -           Sc. suis was eliminated quickly after inoculation of culture media containing

                        fumaric acid (0.352 % fumaric acid in THB: detection of none of the used

                        strains possible after 1 h). This effect declined with decreasing acid

                        concentrations. Meanwhile, lactic acid (max. 0.067 %) and copper (max.

                        150 mg/kg) had no effect on survival of Sc. suis in the concentrations used.

 

Possibility of/Influences on an oro-gastro-intestinal infection with Sc. suis in/ex vivo

 

            -           In the infection trial with Sc. suis only the serotype-9-strain A3286/94 could be

                        detected in one animal (tonsil!), while none of the other animals showed proof

                        of the applicated pathogens in any examinated tissue. Therefore clinical

                        findings (fever, apathy) as well as pathohistological alterations were never

                        associated with a proof of pathogen and occurred in the control group as well.

            -           An oro-gastro-intestinal infection of weaned piglets with the used strains of

                        Sc. suis was not possible under the conditions described.

            -           In consecutive ex-vivo-trials, none of the Sc. suis strains used could be

                        detected 30 min after inoculation of stomach content, not even at the quite

                        high pH (4.71±0.227) of a stomach content after feeding a fine pelleted diet.

 

These investigations showed significant differences regarding the survival of S. Derby and Sc. suis in stomach content ex vivo. The results are consistent with an adaption of S. Derby to an oro-gastro-intestinal route of infection. The extremely efficient elimination of Sc. suis in stomach content ex vivo underlines the important bactericidal function of the stomach barrier and contravenes a potential oro-gastrointestinal route of infection of Sc. suis in weaned piglets.

A coarser feed structure can reduce the number of orally invading Salmonella with zoonotic relevance essentially by a more efficient stomach barrier (fundus!). Therefore a reduction of grinding intensity in compound feed production has considerable impact regarding the prevention of oral infections. A coarse meal diet can accomplish an essential contribution to maintain health of young piglets in the flat-deck-period.

keywords

Salmonella Derby, Streptococcus suis, Futterstruktur, weaned piglet, feed structure, infection

kb

4.368