Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Frauke Juliane Köster (geb. Buck)

Etablierung sensitiver biochemischer Methoden zum

Nachweis der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie

in peripheren Organen infizierter Ziegen und Rinder

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111354

title (eng.)

Establishment of ultrasensitive biochemical methods for the detection of Bovine Spongiform Encephalopathy prions in peripheral organs of infected goats and cattle

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/koesterf_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Der Nachweis von Prionen in peripheren Organen stellt auf Grund der geringen Konzentration von PrPSc eine Herausforderung dar. Um Gewebeproben von verschiedenen Nerven, Ganglien und lymphatischen Geweben untersuchen zu können, sollten in dieser Arbeit die Nachweismethoden Real-time Quaking-induced Conversion (RT-QuIC) und Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) etabliert werden. Mit diesen hoch-sensitiven Methoden wurden Proben von Pathogenesestudien zu BSE bei der Ziege und zur atypischen BSE bei Rindernuntersucht.

Bei der RT-QuIC wird als PrPC-Quelle rekombinantes PrP (recPrP) verwendet, so dass ebenfalls die Herstellung dieses Proteins etabliert wurde. Für die Untersuchung der Ziegenproben wurde bovines recPrP verwendet. Diese Proben wurden außerdem mittels PTA-Western Blot und Enzymimmunassay (EIA, IDEXX HerdChek® BSE-Scrapie Antigen-Testkit) untersucht und diese Ergebnisse zusammen mit den bereits vorliegenden Ergebnissen von Immunhistochemie- (IHC) und Maus-Bioassay Untersuchungen (Tauscher, 2014) interpretiert. Hierbei konnte auch die Sensitivität der verschiedenen Nachweismethoden verglichen werden, wobei sich zeigte, dass die IHC sensitiver ist als PTA-Western Blot und IDEXX EIA, aber weniger sensitiv als RT-QuIC und Maus-Bioassay. Ferner wurden die atypischen Rinderproben unter Verwendung von bovinem recPrP untersucht. Die Ergebnisse der H-BSE infizierten Tiere wurden mit vorliegenden Ergebnissen von Untersuchungen mittels PTA-Western Blot, IHC und Maus-Bioassay verglichen. Auch hier stimmten die RT-QuIC-Ergebnisse fast vollständig mit den Bioassay-Daten überein. Die Proben der mit L-BSE infizierten Tiere wurden mit bovinem und zusätzlich mit Hamster/Schaf-Chimären recPrP untersucht. Mit dem etablierten C-BSE Protokoll konnten jedoch keine aussagekräftigen Ergebnisse generiert werden. Bezüglich der Untersuchung von Hirngewebe erschien die RT-QuIC insgesamt als die sensitivste Nachweismethode.

Für die Etablierung der PMCA wurde der Zusatz von verschiedenen Kofaktoren untersucht, die für andere TSEn eine amplifikationssteigernde Wirkung haben. Der Einsatz von EDTA, poly(A) RNA und Dextransulfat zeigte jedoch keinen positiven Effekt, da bei einer gesteigerten Amplifikation ebenfalls eine de novo PrPSc-Synthese stattfand und die Versuche folglich nicht ausgewertete werden konnten. Einzig die Verwendung von Glaskügelchen im Versuchsansatz und die Füllung des Ultraschall-Horns mit Ethylenglykol sorgten für eine solide Amplifikation des eingesetzten PrPSc bei der Untersuchung von Hirnproben von C-BSE und eine schwache Amplifikation von H-BSE. Um periphere Proben untersuchen zu können müssen die Versuchsbedingungen für atypische BSE, insbesondere für L-BSE, noch weiter optimiert werden.

abstract (englisch)

The detection of prions in peripheral organs is challenging because of the low concentration of PrPSc and therefore requires very sensitive detection methods. Thus this doctoral dissertation aimed at the establishment of the two detection methods “Real-time Quaking-induced Conversion” (RT-QuIC) and “Protein Misfolding Cyclic Amplification” (PMCA) in order to examine samples of peripheral tissue (nerves, ganglia and lymphatic tissue). These samples originated from pathogenic studies of BSE in goat and atypical BSE.

In the RT-QuIC reaction, recombinant PrP (recPrP) is used as a source of PrPC and the amplification and purification of this protein first needed to be established. The samples derived from the BSE in goat pathogenesis study were tested with bovine recPrP and were furthermore tested in PTA-Western Blot and Enzymimmunoassay (EIA, IDEXX HerdChek® BSE-Scrapie Antigen-Testkit). These results were evaluated in context with the results of immunohistochemically investigations (IHC) and mouse bioassay that had been performed beforehand (Tauscher, 2014). Here the sensitivity of the different detection methods could be compared. The most sensitive detection methods were mouse bioassay and RT-QuIC, followed by IHC, which was more sensitive then PTA Western Blot and EIA. The atypical BSE samples were also tested with bovine recPrP and the results of H-BSE were interpreted together with the available data of these samples from PTA-Western Blot, IHC and bioassay. The results of the RT-QuIC experiments were mostly consistent with the results of the bioassay. The L-BSE samples were tested with bovine and additionally with hamster/sheep-chimeric recPrP, but with the established protocol no conclusive results could be generated. Altogether, regarding the examination of brain-tissue, the RT-QuIC seems to be the most sensitive method.

For different TSEs it had been described, that the usage of different cofactors in PMCA may enhance the rate of PrPSc amplification. The addition of EDTA, poly(A) RNA and Dextransulfate were therefore tested but showed no positive effect. If the amplification rate increased, then there was also spontaneous PrPSc generation, so the experiments couldn’t be evaluated. C-BSE brain-samples showed a solid amplification and samples from H-BSE showed a weak amplification when glass beads were added to the reaction mix and the ultrasonic cup horn was filled with ethylene glycol. For the analysis of peripheral samples from animals infected with atypical BSE (especially L-BSE) the experimental conditions have to be further optimized.

keywords

Bovinen Spongiformen Enzephalopathie, Real-time Quaking-induced Conversion, Protein Misfolding Cyclic Amplification

Bovine Spongiform Encephalopathy

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