Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Jörgen Köhlbrandt

 

 Einfluss boviner Trophoblastprodukte auf die Synthese und den Umbau der Extrazellulären Matrix (EZM) durch plazentare Fibroblasten in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106585

title (engl.)

Influence of bovine trophoblast products on the synthesis and remodeling of extracellular Matrix (ECM) in placental fibroblasts in virto

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/koehlbrandtj_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Der Umbau der endometrialen und plazentaren EZM ist ein entscheidender Prozess für einen physiologischen Ablauf der Trächtigkeit beim Rind. Es ist noch nicht bekannt, welche Regulationsmechanismen dieser Remodellierung der EZM zu Grunde liegen. Als regulatorische Zellen kommen die Trophoblastriesenzellen (TGC) in Frage, weil ihre Produkte durch Hybridzellen in das endometriale, plazentare Stroma exozytiert werden. Diese Produkte wiederum könnten parakrine Wirkungen auf die stromalen Fibroblasten haben. Fibroblasten besitzen die Fähigkeit zur Synthese von Matrixmolekülen und Matrixmetalloproteinasen (MMP), welche für den Umbau der EZM hauptverantwortlich sind.

Daher wurde in dieser Arbeit der Einfluss der TGC-Produkte auf die Synthese und den Umbau der EZM durch bovine, plazentare Fibroblasten untersucht. Für die Versuche wurden aus Rinderplazentomen isolierte Fibroblastenzelllinien in einem Zellkulturmodell mit unterschiedlichen trophoblastären Faktoren stimuliert und die Expression von MMP, Tissue Inhibitors of Matrix-Metalloproteinases (TIMP) und verschiedenen EZM-Komponenten analysiert. Als Stimulanzien wurden Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin-like Growth Factor (IGF1) -1, -2, Fibroblasten-wachstumsfaktoren (FGF) -1, -2, -4, -7, EGF + IGF1, EGF + IGF2, bovines plazentares Laktogen (bPL) und kotyledonen-konditioniertes Medium (KKM) verwendet. Anschließend erfolgte mittels RT-PCR eine Erfassung des mRNA-Expressionsprofils von MMP1, -2, -8, -9, -14, TIMP1, -2 sowie von Kollagen I, -IV, Laminin B, Laminin C und Fibronektin. Stimulanzien, die vielversprechende Expressionsveränderungen der untersuchten Gene auf mRNA-Ebene hervorriefen, wurden mittels quantitativer Real-time PCR näher analysiert. Weiterhin wurden auf mRNA-Ebene beeinflusste Gene mittels Western Blot und Zymographie auf Proteinebene weitergehend untersucht. Abschließend wurden mittels MTT-Assay (Zellproliferation) und Live-Cell Imaging (Zellmotilität) biologische Wirkungen der Stimulanzien auf die kultivierten Fibroblasten ermittelt.

Die Untersuchungen der Genexpression zeigten eine erhöhte mRNA-Expression von MMP1 durch FGF2 (1,14fach) und KKM (1,23fach). Im Gegensatz dazu verringerte die Stimulation mit FGF7 (0,9fach) und bPL (0,91fach) die MMP1-Expression. Auf Proteinebene (Western Blot) zeigten diese Faktoren die gleiche Tendenz die Expression von MMP1 zu beeinflussen, jedoch nicht auf signifikantem Niveau. Mittels Zymographie konnte keine erhöhte proteolytische MMP1-Aktivität dargestellt werden. MMP14 wurde auf mRNA-Ebene durch FGF2 (0,81fach), FGF4 (0,87fach) und KKM (0,87fach) in der Expression signifikant herunter reguliert, wobei sich diese Veränderungen nicht auf Proteinebene darstellen ließen. TIMP2-mRNA wurde durch KKM (2,75fach) deutlich hochreguliert, wohingegen TIMP2 auf Proteinebene nicht detektiert werden konnte. Das Expressionsprofil von MMP9 wurde nur geringfügig auf mRNA-Ebene beeinflusst, während MMP2 und TIMP1 in ihrer Expression unverändert blieben. MMP8 konnte nicht in ausreichender Menge detektiert werden. Die Expression von Laminin mRNA verringerte sich durch Behandlung mit FGF4 (0,88fach), FGF7 (0,87fach) und bPL (0,81fach) signifikant, ohne dass diese Veränderung auf Proteinebene sichtbar gemacht werden konnte. FGF2 (1,42fach) und KKM (1,23fach) induzierten eine erhöhte Expression von Kollagen I mRNA, wohingegen Kollagen IV durch FGF7 (0,77fach) und bPL (0,81fach) verringert wurde. Fibronektin zeigte keine Regulation durch die TGC-Produkte.

Die Fibroblastenmotilität ließ sich durch FGF2 (1,15fach), EGF+IGF1 (1,55fach) und KKM (1,32fach) steigern, wobei FGF7 (0,92fach) wiederum einen hemmenden Einfluss hatte. Weiterhin wurde die Zellproliferation der Fibroblasten durch IGF1 (1,19fach) und IGF2 (1,16fach) angeregt, während die Inkubation mit bPL (0,74fach) zu einer Verminderung der Zellvermehrung führte.

In der vorgelegten Arbeit konnten parakrine Wirkungen bestimmter TGC-Faktoren auf die Expression der MMP/TIMP und der EZM-Moleküle in plazentaren Fibroblasten aufgedeckt werden, die zu folgender Arbeitshypothese führten: Der invadierende Trophoblast induziert über seine Produkte eine gesteigerte (FGF2, KKM) oder eine abgeschwächte (FGF7, bPL) Expression von matrixdegradierenden Enzymen sowie Matrixmolekülen. Dieses suggeriert eine von TGC-Produkten regulierte (orchestrierte) Balance zwischen Gewebeaufbau und Gewebeabbau über die bovine, endometriale EZM, welche möglicherweise für das Remodelling während der Implantation und der weiteren EZM-Umbauprozesse während der Trächtigkeit verantwortlich ist. Die Analysen des KKM lassen vermuten, dass in vivo eventuell kumulative Effekte mehrerer Faktoren eine deutlichere Regulation auf mRNA- und Proteinebene bewirken. Weiterführend können die Ergebnisse dieser Arbeit helfen, physiologische Prozesse wie die Trophoblastinvasion, die Ablösung der Nachgeburt oder die postpartale Regression besser zu verstehen.

abstract (englisch)

Remodeling of the endometrial and placental ECM is a key process for the physiology of bovine gestation. It is not yet known, which mechanism of regulation underlie this remodeling of the ECM. TGC are considered to be the regulatory cells, because their products are exocytosed by hybrid cells into the endometrial, placental stroma. These products could have paracrine effects on the stromal fibroblasts. Fibroblasts have the ability to synthesize matrix molecules and matrix metalloproteinases (MMP), which are mainly responsible for the alterations of ECM.

Therefore in the present study the influence of trophoblast giant cell (TGC) products on the synthesis and the remodeling of ECM of bovine placental fibroblasts was investigated. For the experiments fibroblast cell lines isolated from bovine placentomes were stimulated and the expression of MMP, TIMP and different ECM components were analysed. Stimulants used were epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF) -1, -2, fibroblast growth factor (FGF) -1, -2, -4, -7, EGF + IGF1, EGF + IGF2, bovine placental lactogen (bPL) and cotyledonen-conditioned medium (KKM). RT-PCR was used to analyse the mRNA expression profiles of MMP1, -2, -8, 9, -14, TIMP1, -2 as well as collagen I, -IV, laminin B, laminin C and fibronectin. Stimulants which induced promising changes in the expression of the studied genes on mRNA level were further analysed by qRT-PCR. Furthermore, genes influenced on mRNA level were analysed on protein level by western blot and zymography. Biological effects of the factors on the cultured fibroblasts were determined by MTT assay (cell proliferation) and by live-cell imaging (cell motility).

The study of gene expression showed an increased MMP1 mRNA expression after treatment with FGF2 (1.14times) and KKM (1.23times). In contrast, the MMP1 mRNA expression was decreased by stimulation with FGF7 (0.9times) and bPL (0.91times). On protein level (western blot) these factors showed the same tendency to influence the expression of MMP1, but did not reach the level of significance. By zymography no increased proteolytic activity could be shown. MMP14 was significantly down-regulated on mRNA level by FGF2 (0.81times), FGF4 (0.87times) and KKM (0.87times), whereas these changes could not be determined on protein level. TIMP2 mRNA was considerably up-regulated by KKM (2.75times), whereas TIMP2 could not be detected on protein level. The expression profile of MMP9 on mRNA level was only slightly influenced, while MMP2 and TIMP1 remained unchanged in their expression. MMP8 mRNA could not be detected in an adequate quantity. The expression of laminin was decreased significantly by treatment with FGF4 (0.88times), FGF7 (0.87times) and bPL (0.81times), without showing these changes on protein level. An enhanced expression of collagen I mRNA was induced by FGF2 (1.42times) and KKM (1.23times), whereas collagen IV mRNA was decreased by FGF7 (0.77times) and bPL (0.81times) treatment. Fibronectin was not regulated by the TGC products. The fibroblast motility could be increased by FGF2 (1.15times), EGF+IGF1 (1.55times) and KKM (1.23times), whereas FGF7 in turn had inhibiting influence (0.92times). Furthermore, the cell proliferation of fibroblasts was stimulated by IGF1 (1.19times) and IGF2 (1.16times), while the incubation with bPL led to a reduction of proliferation (0.74times).

In the present study paracrine effects of certain TGC factors on the expression of MMP/TIMP and ECM molecules could be revealed. This led to the following working hypothesis: The invading trophoblast induces by his products an increased (FGF2, KKM) or a decreased (FGF7, bPL) expression of matrix degrading enzymes as well as matrix molecules. This suggests that TGC products are responsible for a regulated (orchestrated) balance between tissue establishment and degradation via the bovine, endometrial ECM, which is potentially responsible for the remodelling during implantation and the further ECM reorganisation process during gestation. The results concerning the KKM allow the conclusion, that in vivo possibly cumulative effects of several factors cause a distinct regulation on mRNA and protein level. In the future the results of this study may help to improve the understanding of physiological processes like the trophoblast invasion, the release of fetal membranes or the postpartum uterine regression.

keywords

Bovine Trophoblast, Extrazelluläre Matrix, Fibroblasten, matrix metalloproteinases, remodeling, FGF2

kb

1.340