Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Anna Malgorzata Koczula

 

Metabolic adaptation of Streptococcus suis

to different environments

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109240

title (ger.)

Metabolische Anpassung von Streptococcus suis an unterschiedliche Milieus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/koczulaa_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Streptococcus (S.) suis ist ein zoonotischer Erreger, der zu schwerwiegenden Erkrankungen wie Meningitis, Septikämie und Endokarditis beim Schwein als auch beim Menschen führen kann. Es wird angenommen, dass die Etablierung invasiver Infektionen von der Regulation der Virulenzfaktoren sowie der Expression metabolischer Gene abhängt, da sich S. suis effizient an unterschiedliche Bedingungen, wie z.B. der Verfügbarkeit von Nährstoffen, die sich im Blut und der Zerebrospinalflüssigkeit (ZSF) des Wirts unterscheiden, anpassen muss. Aus diesem Grund konzentrierte sich diese Studie auf die Charakterisierung von Stoffwechselwegen, die möglicherweise bedeutend für die biologische „Fitness“ von S. suis unter verschiedenen Umweltbedingungen sind.

Die Ergebnisse der Studie sind in vier Hauptteile gegliedert. Im ersten Teil (Kapitel 3) wurde zunächst die de novo - Aminosäurebiosynthese von S. suis unter chemisch definierten Bedingungen sowie ex vivo in porzinem Blut und ZSF mittels „isotopologue profiling“ untersucht, um Zentralstoffwechselwege von S. suis aufzuklären und mögliche Unterschiede bezüglich dieser Wege aufzudecken. Aufgrund der höchsten 13C Anreicherung in Ala, Asp, Ser und Thr in vitro wird angenommen, dass die Metabolisierung von Glucose überwiegend über den Embden-Meyerhof-Parnas Weg verläuft. Niedrige Markierungsraten aromatischer Aminosäuren (Tyr und Phe) deuten auf eine geringe Beteiligung des Pentosephosphatwegs hin. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass S. suis einige Aminosäuren eher aus der Umgebung aufnimmt, als diese de novo zu synthetisieren. Ähnliche Ergebnisse wurden in porzinem Blut und ZSF beobachtet, die auf einen stabilen EMP Weg, unabhängig vom Milieu, hindeuten.

Das Fehlen effizienter Mutagenesesysteme erschwert die Untersuchungen metabolischer Wege in S. suis. Aus diesem Grund wurde eine Cre-lox basierende Mutagenesetechnik für die Inaktivierung von Genen in S. suis etabliert. Der Vorteil dieser Methode ist der Gebrauch eines selektiven Markers, der anschließend von der Cre Rekombinase entfernt wird, um eine Beeinflussung der Genexpression am 3´und 5´ Ende zu vermeiden. Wie in Kapitel 4 und 5 beschrieben, wurde gezeigt, dass diese Technik die Inaktivierung ganzer Operons, die aus mehreren Genen bestehen, ermöglicht.

Die metabolische Anpassung von S. suis an porzines Blut und ZSF ex vivo wurde außerdem auf der Ebene der Genexpression untersucht (Kapitel 5). Die meisten unterschiedlich exprimierten Gene im Blut konnten mit dem Kohlenhydrat-metabolismus und – transport assoziiert werden. Dabei deutete die verstärkte Expression diverser Gene, die für Zuckertransportsysteme kodieren, auf eine Aufnahme unterschiedlicher Kohlenhydrate hin. Der Vergleich unserer Ergebnisse mit einer früheren Studie zeigt weiterhin, dass die Regulation des Pentosephosphatwegs, der unter anderem für die Synthese von Nukleinsäuren wichtig ist, als auch die Regulation von Kohlenhydrattransportsystemen von der Inkubationszeit von S. suis in dem entsprechenden Milieu abhängt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass nach dem Wachstum von S. suis im ZSF insbesondere Gene, die an der Translation sowie der Aminosäureaufnahme und – biosynthese beteiligt sind, unterschiedlich exprimiert werden. Die verstärkte Expression dieser Gene kann durch den Verbrauch entsprechender Aminosäuren aus der ZSF durch S. suis erklärt werden. Um die Bedeutung der stark exprimierten Gene für das Überleben von S. suis zu überprüfen, wurden ausgewählte metabolische Gene mittels Cre-lox Mutagenese inaktiviert. Dies führte jedoch zu keinen phänotypischen Veränderungen zwischen den Mutanten und dem Wildtyp-Stamm. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um Gene, die für die „Fitness“ von S. suis essentiell sind, zu identifizieren.

Für die Anpassung des Metabolismus an verschiedene Bedingungen im Wirt benötigt S. suis vermutlich transkriptionelle Regulatoren, die Unterschiede im Milieu wahrnehmen und folglich die Expression metabolischer Gene modulieren. Im vierten Teil der Studie (Kapitel 6) wurde die Funktion eines solchen Regulators, dem FlpS, untersucht. Anhand von Wachstumsexperimenten, Transkriptomanalysen, „isotopologue profiling“ und experimentellen Mausinfektionen konnte gezeigt werden, dass FlpS ein Sauerstoff-wahrnehmender Regulator und essentiell für die Expression von arcABC ist, das für das „Arginine Deiminase System“ kodiert. Dieses System ist beteiligt am Schutz vor Stress durch einen sauren pH-Wert und der Bereitstellung von Energie in Form von ATP. Darüber hinaus ist FlpS wichtig für die Regulation metabolischer Gene.

Zusammenfassend geben die Ergebnisse der vorliegenden Studie neue Einblicke in die Anpassung von S. suis an unterschiedliche Wirtshabitate und tragen damit zu einem besseren Verständnis der Infektionsprozesse bei und können so helfen bessere Strategien zu entwickeln, um S. suis Infektionen kontrollieren zu können.


 

abstract (englisch)

Streptococcus (S.) suis is a zoonotic pathogen that can cause severe pathologies such as meningitis, septicemia, and endocarditis in pigs as well as in humans. It is proposed that the establishment of invasive diseases depends not only on the regulation of virulence factors but also on the expression of metabolic genes, since S. suis needs to efficiently adapt to environmental stimuli such as different nutrients in specific host habitats such as blood or cerebrospinal fluid (CSF). Therefore, this study focused on the identification and characterization of metabolic pathways presumably important for the biological fitness of S. suis under different environmental conditions.

The study is divided into four main results parts. In the first part (Chapter 3) amino acid auxotrophies of S. suis were determined and de novo amino acid biosynthesis of S. suis under chemically defined in vitro conditions by 13C-isotopologue profiling analyzed in order to elucidate the core metabolic pathways. These analyses were also applied under more complex conditions, i.e. porcine blood and CSF. In general, highest 13C enrichments were observed in Ala, Asp, Ser, and Thr under in vitro conditions indicating predominant glucose catabolization by the Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway. Lower relative labeling rates of aromatic amino acids (Tyr and Phe) revealed a minor contribution of the pentose-phosphate pathway (PPP) in glucose metabolism. Furthermore, results indicate a preferred uptake of some amino acids from the environment instead of utilizing de novo biosynthesis. Overall, similar results were obtained in porcine CSF and porcine blood indicating a stable EMP pathway independent of the environment.

Analysis of metabolic pathways in S. suis is hampered by the lack of efficient mutagenesis systems and, therefore, a Cre-lox based mutagenesis technique for gene deletion in S. suis was established. The advantage of this method is the utilization of a counter selectable marker which can subsequently be removed by a Cre recombinase in order to avoid side effects on the expression of downstream or upstream located genes. This recombinase recognizes specific DNA (loxP sites) and removes the selectable marker which is flanked by two loxP sites. As described in Chapters 4 and 5, it could be shown that this technique allowed the inactivation of complete operons consisting of several genes.

In the third part (Chapter 5), the metabolic adaptation of S. suis to porcine blood and CSF ex vivo was investigated on a gene expression level. Remarkably, the most differentially expressed genes during growth of S. suis in blood were associated with carbohydrate metabolism and transport, for example, several phosphotransferase systems in comparison to gene expression in THB medium. This suggested the uptake of various carbohydrates by S. suis. Comparison of our results with a previous study revealed that the regulation of the PPP and carbohydrate transporter systems increases with the time of incubation. After proliferation of S. suis in CSF, especially genes involved in protein translation as well as amino acid biosynthesis and - uptake were differentially expressed. The increased expression of these genes could be explained by a consumtion by S. suis of associated amino acids from the CSF. As a consequence S. suis might initiate biosynthesis of these amino acids in addition to their uptake. Inactivation of selected metabolic genes by Cre-lox mutagenesis did not show phenotypical differences between the mutant and the wildtype strain. Thus, to detect essential genes for S. suis fitness in the tested host environments further investigations are needed.  

In order to adapt its metabolism to different conditions in the host, S. suis might also rely on transcriptional regulators that directly or indirectly sense environmental changes and modulate the expression of metabolic genes. Thus, in the fourth part (Chapter 6) the function of a putatively oxygen-sensing FNR-like protein of S. suis, FlpS was analyzed. By growth experiments, transcriptome analysis, isotopologue profiling and mice infection experiments it was found that FlpS is an oxygen-sensing regulator essential for the expression of arcABC encoding for the arginine deiminase system, which plays a role in protection against acidic stress and provides energy in form of ATP. Furthermore, FlpS seems to be important for the regulation of several metabolic genes.

In conclusion, results of the present study provide novel insights into the adaptation of S. suis to host environments which might contribute to our understanding of infection processes and can help to develop better strategies for control of S. suis infections.

keywords

Streptococcus suis, Matabolismus, Mutagenese, meatbolism mutagenesis, transcriptional regulation

kb

3.206