Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Christine Klinge

 

Quantitative Strukturanalyse der Mäuselunge mit stereologischen Methoden: Korrelation von Micro-CT und Histologie

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103166

title (engl.)

Quantitative structural analysis of mice lungs with stereological methods: Correlation of micro-CT and histology

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/klingec_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Ein Atlas der gesunden und in weiterführenden Arbeiten der erkrankten Mäuselunge soll dazu dienen, strukturellen Veränderungen des Lungengewebes während oder nach einer Lungenerkrankung zu entschlüsseln und durch Tiermodelle Therapiemöglichkeiten aufzuweisen. Unterschiedliche Lungenerkrankungen wie z.B Karzinome der Lunge, Lungenemphysem oder bronchopulmonale Dysplasie bei Neugeborenen sind in der Humanmedizin häufig vorkommende Krankheitsbilder, welche mit einer deutlichen Schädigung des Alveolarepithels einhergehen. Mit Hilfe von design-basierter Stereologie wurde eine Vergleichsstudie zur Quantifizierung von Lungengewebe durchgeführt. Mit zwei verschiedenen Methoden (Lichtmikroskopie und Micro-CT) gewonnene Daten wurden anhand verschiedener Parameter miteinander verglichen. Die Stereologie ermöglicht die Gewinnung dreidimensionaler Strukturparameter anhand der Auswertung von zweidimensionalen Schnitten und liefert exakte quantitative Informationen des zu untersuchenden Gewebes. Mit Hilfe dieser Methode ist auch die Validierung quantitativer Micro-CT-Befunde sowie eine Erweiterung dieser Befunde in höhere Auflösungsbereiche möglich.

Für das Projekt wurden 10 männliche Mäuse, 4 im Alter von 12 Wochen und 6 im Alter von 91 Wochen des Stammes C57BL/6, im Comprehensive Lung Imaging Center in Iowa für Organproben geopfert und die Lungen anschließend mit modifizierter Heitzman Lösung über die Vena cava caudalis perfusionsfixiert. In Iowa erfolgte die nicht-destruktive Auswertung der Lungen mit dem Micro-CT, d.h. die Lungen wurden getrocknet, virtuell in Scheiben geschnitten und schließlich für die Analyse in zwei unterschiedlichen Auflösungen gescannt. In Hannover erfolgte im ersten Schritt die Separierung der Herzen von den Lungen, um mittels Wasserverdrängung das totale Lungenvolumen zu bestimmen. Um die Lungen besser in gleiche Stücke schneiden zu können wurden diese in 4% Agar eingebettet und anschließend mit dem Gewebeschneider in Scheiben geschnitten. Einer repräsentativen Probenentnahme (systematic uniform random sampling) schloss sich die Nachfixierung und Einbettung in Glycolmetacrylat an, welche von großer Bedeutung für die Aushärtung des Gewebes ist, bevor die Blöckchen mit dem Microtom in 1,5µm dicke Scheiben geschnitten und in einem letzten Schritt mit Toluidinblau oder Orcein gefärbt wurden. Folgende Parameter wurden bestimmt: Alveolenzahl- und größe, Alveolarepitheloberfläche, mittlere Septendicke sowie die Volumenanteile von Septalgewebe, alveolärem und ductalem Luftraum.

Vergleicht man die mit den beiden Methoden gewonnenen Daten, fällt auf, dass die Alveolenzahl in den Micro-CT Auswertungen signifikant höher war als bei den mittels Lichtmikroskopie gewonnenen Daten (Micro-CT: 1,86*106; LM: 1,27*106), während die Oberfläche im Lichtmikroskop deutlich größer erschien als in der Micro-CT Untersuchung (LM: 547,82cm2; Micro-CT: 393,06cm2). Diese paradoxen Ergebnisse lassen sich wie folgt erklären: (1) Die Möglichkeit in der Lichtmikroskopie bestimmte Strukturen durch Färbung hervorzuheben, wie hier die elastischen Fasern an den Alveolareingängen, erlaubt eine exaktere und kritischere Beurteilung der Zählereignisse und hat in diesem Fall eine geringere Zahl ergeben. (2) Durch die höhere Auflösung des Lichtmikroskops wird die Oberfläche der Alveolen detaillierter wahrgenommen, wodurch sich die größere Oberfläche erklären lässt. Allerdings ist ein entscheidender Vorteil auf Seiten des Micro-CTs die weitaus weniger aufwendige und nicht-destruktive Art der Verarbeitung und Untersuchung des zu untersuchenden Gewebes. Daher sollte die Methode der Wahl in Abhängigkeit von der Fragestellung der Studie gewählt werden. Eine stereologische Auswertung mit dem Lichtmikroskop liefert zwar exaktere Ergebnisse, ist allerdings wesentlich zeit- und arbeitsaufwendiger als eine Auswertung mit dem Micro-CT.

Aufgrund der Tatsache, dass die Mäuse in dieser Studie zwei unterschiedlichen Altersgruppen (12 Wochen und 91 Wochen) angehörten, lassen sich die Daten ebenfalls in Bezug auf das Alter miteinander vergleichen. Auffällig war die signifikant höhere Alveolenzahl bei den 91 Wochen alten Tieren im Vergleich zu den 12 Wochen alten Tieren, welche auf eine späte Alveolarisierung bei der Maus in dieser Phase schließen lässt. Vorangegangene Studien gingen bereits davon aus, dass eine spätere Phase der Alveolenbildung bei Mäusen stattfindet, aber untersucht wurde diese Annahme bislang nur unter pathologischen nicht jedoch unter physiologischen Bedingungen. Die in dieser Studie erhobenen Daten zeigen, dass es durchaus eine späte Alveolarisierung in Mäuselungen gibt, die nach Abschluss der Reife, d.h. nach einem Alter von drei Monaten, stattfindet.

Interessant wäre es, dieses Modell für weiterführende Arbeiten zu nutzen und genau zu untersuchen auf welchen Zeitraum sich die physiologische Alveolenbildung beschränkt bzw. wann diese beendet ist.

 

abstract (englisch)

An atlas of healthy and in further studies diseased mice lungs shall give information on structural changes in lung tissue during or after a lung disease. Animal models may lead to a better understanding of different lung diseases and the development of new therapy possibilities. Common diseases like lung cancer, emphysema or bronchopulmonary dysplasia in newborn children go along with a significant damage of alveolar epithelium. With design-based stereology a comparative study in quantifying lung tissue was accomplished. The data obtained through two different methods, light microscopy and micro-CT, were compared to each other, regarding different parameters. Stereology allows the extraction of quantitative information out of three-dimensional material from measurements made on two-dimensional planar sections of the material or tissue. It can also be applied to validate quantitative micro-CT data and the extension of these to a higher resolution.

For this study, 10 male mice, 4 at the age of 12 weeks and 6 at the age of 91 weeks (C57BL/6) were sacrificed at the Comprehensive Lung Imaging Center in Iowa. Lungs were perfusion fixed with modified Heitzman solution via the caudal cava vein.

At this institution, a non-destructive assessment via micro-CT took place. The lungs first were dried, virtually sectioned and then scanned at two different magnifications to do the analysis. In Hannover, in a first step the heart was removed from the lungs to obtain the total volume of the lungs by using fluid displacement. To facilitate cutting the lungs into equal slices they were embedded in 4% agar. Then they were sectioned with a tissue slicer. Representative samples were selected by a systematic uniform random sampling scheme. Subsequently, the samples were post-fixed and embedded into glycol metacrylate, which is crucial for the hardening. Finally, the lungs were cut into 1,5µm thick sections which were stained either with toluidine blue or with orcein. The following parameters were determined: alveolar number and size, alveolar surface area, mean septal thickness and the volume of septal tissue, alveolar and ductus airspace.

Comparing both methods, it became obvious that the number of alveoli obtained via micro-CT was significantly higher than the number estimated by light microscopy (micro-CT: 1,86*106; LM: 1,27*106). In contrast, the alveolar surface area measured by light microscopy appeared larger than in micro-CT assessment (LM: 547,82cm2; micro-CT: 393,06cm2). These paradox results may be able to be explained as follows: (1) The application of specific stainings to highlight certain structures, like the elastic fibers marking the alveolar openings, allows a more detailed histomorphometry. This led to a significantly lower number of alveoli obtained via light microscopy estimation. (2) Because of the higher resolution in light microscopy, the alveolar surface area can be identified more accurately, which could explain a larger surface. However, a major advantage of micro-CT is the non-destructive processing and examination of the lungs. The method of choice should be chosen according to the question of the study, stereology assessment via light microscopy provides more accurate data, but related to the amount of work and the expenditure of time the estimation via micro-CT might be more efficient.

Due to the fact, that the mice used in this study, belonged to two different age groups (12 weeks and 91 weeks), the effect of age can also be analyzed. Interestingly, the number of alveoli is significantly higher in the 91 weeks old animals than in the group of the 12 weeks old animals, which leads to the assumption that a late alveolarization takes place in the mouse during this period of time. Previous studies provided evidence that a second phase of alveolarization may occur under pathological conditions in the adult mouse lung, but there are no data regarding late alveolarization under physiological conditions. The data presented in this study shows that in mice lungs a late alveolarization takes place after maturity has been reached (after 3 months).

Future studies utilizing the presented model are necessary to determine the time period of physiological alveolarization and its end.

 

keywords

Stereologie, Lunge, Lichtmikroskopie; stereology, lung, light microcopy

kb

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