Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sophie Kittler

Untersuchungen zur Effektivität von Bakteriophagen unter Praxisbedingungen im Rahmen von Minimierungsstrategien von Campylobacter beim Broiler

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104903

title (engl.)

Application field trials on bacteriophage efficacy for reduction of Campylobacter

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/kittlers_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Campylobacter spp. ist einer der häufigsten Erreger lebensmittelbedingter Durchfallerkrankungen in westlichen Industrieländern. Er ist ein kommensales Bakterium des Magen-Darm-Traktes von Geflügel. Das Robert Koch-Institut meldet jährlich steigende Zahlen humaner Infektionen bzw. eine stabile Zahl an Erkrankten auf hohem Niveau. Hauptinfektionsquellen für den Menschen sind kontaminiertes Geflügelfleisch und die Geflügelhaltung allgemein. Das effektivste Mittel zur Bekämpfung der humanen Campylobacteriose ist, Campylobacter in der Primärproduktion zu reduzieren. Die Anwendung von Bakteriophagen wird als Reduktionsstrategie diskutiert. Bakteriophagen sind Viren, die gezielt Bakterien einer Spezies oder eines Stammes infizieren und töten.

Ziel dieser Dissertation war es, einen in vitro zusammengestellten Bakteriophagen Cocktail auf seine Effektivität zur Reduktion von Campylobacter in Hähnchenmastbetrieben zu testen und Empfehlungen für diese Anwendung von Bakteriophagen zu entwickeln.

Es wurde ein Vorversuch durchgeführt, der die Effektivität des in vitro zusammengestellten Bakteriophagen Cocktails in vivo bestätigte. Untersuchungen auf Campylobacter und Bakteriophagen erfolgten 1, 3, 7, 14, 21 und 28 Tage nach der Phagenapplikation. In diesem Vorversuch trat drei Tage nach der Phagenapplikation in der Versuchsgruppe eine signifikante Campylobacter- Reduktion von 1,7 KbE/g Blinddarminhalt verglichen mit der Kontrollgruppe auf. Anschließend fanden erstmals drei Feldversuche in kommerziellen Hähnchenmastbetrieben statt. Es wurden jeweils neun Kotproben pro Gruppe vor der Applikation von Bakteriophagen sowie an drei bis fünf regelmäßigen Terminen bis zur Schlachtung auf Campylobacter und Bakteriophagen untersucht.  Bei der Schlachtung wurden jeweils neun Blinddarmproben vom Schlachtband zur Untersuchung entnommen. Eine signifikante Reduktion von Campylobacter trat in zwei Versuchen auf. In einem dieser Versuche wurde Campylbacter einen Tag nach der Applikation von Bakteriophagen unter die Nachweisgrenze gesenkt (50 KbE/g Kot; P= 0,014). In einem zweiten Versuch kontaminierten Bakteriophagen die Kontrollgruppe, was zu einer signifikanten Reduktion führte (P= 0,002). Bakteriophagen wurden in allen Feldversuchen in den Kot bzw. Blinddarmproben der Versuchsgruppen und in der Kontrollgruppe des dritten Feldversuches nachgewiesen. Während der Versuche wurden etwa hundert Campylobacter Isolate pro Gruppe und Untersuchungszeitpunkt aus den Proben gewonnen. Isolate aller Gruppen wurden auf ihren Biotyp untersucht. In zwei Versuchsgruppen verschob sich das Verhältnis der Biotypen nach der Phagenapplikation zugunsten eines Biotyps (Biotyp 1 in Feldversuch 2; Biotyp 2 in Feldversuch 3). Zur weiterführenden Untersuchung der Kolonisationsprozesse unter dem Einfluss von Bakteriophagen wurden alle 668 im  dritten Feldversuch gewonnenen Isolate auf die Phagen-Empfänglichkeit, die Motilität und auf die Aktivität des Enzyms Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) untersucht. Motilität und GGT-Aktivität sind Kolonisationsfaktoren. Sie korrelierten in der vorliegenden Untersuchung mit der Phagen-Empfänglichkeit. Phagen-empfängliche Isolate zeigten eine höhere Motilität und GGT-Aktivität. Sie wurden in Anwesenheit von Bakteriophagen häufiger isoliert als die unempfänglichen Isolate. Die Ergebnisse legen nahe, dass die phagen-empfänglichen Isolate die unempfänglichen Isolate aufgrund erhöhter Kolonisationsfähigkeit verdrängen konnten. MLST, MALDI-TOF und biochemischer Charakterisierung zeigten in den anschließend durchgeführten phylogenetischen Analysen keine Übereinstimmung der Cluster.

In dieser Studie wurden erstmals Versuche zur Anwendung Campylobacter-spezifischer Bakteriophagen unter kommerziellen Bedingungen durchgeführt. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass Bakteriophagen auch unter Feldbedingungen zu einer signifikanten Reduktion von Campylobacter führen können. Es sind jedoch weitere Untersuchungen und Entwicklungen nötig, um reproduzierbare Ergebnisse in der Hähnchenmast zu erreichen. Es ließen sich anhand dieser Versuche Empfehlungen für die Phagenapplikation entwickeln, deren Anwendung zu reproduzierbaren Ergebnissen beitragen soll. Außerdem wurde die Populationsdynamik von Campylobacter in einem der Feldversuche untersucht. Phagen-unempfängliche Isolate wiesen eine reduzierte Kolonisation auf. Die Untersuchungen identifizierten zwei Kolonisationsfaktoren, die in diesen Isolaten vermindert waren: Motilität und GGT-Aktivität. Das Wissen um die Interaktion zwischen Bakteriophagen und Bakterien sowie der Kolonisation der Bakterien im Wirtsorganismus muss weiter ausgebaut werden, um eine effektive und nachhaltige Anwendung von Bakteriophagen zu ermöglichen.

abstract (englisch)

Campylobacter spp. is a commensal of the bird’s intestine. It is one of the most frequent causes of foodborne illnesses in the western world. The Robert Koch Institute still recognizes an annually increasing or rather stable high incidence of human campylobacteriosis. Poultry meat and poultry keeping are the main sources of human infections. Reducing Campylobacter in primary production is the most effective measure for controlling the disease. Bacteriophage application is currently under discussion as a measure for Campylobacter reduction. Bacteriophages are viruses that infect and kill bacteria.

The aim of this study was to test the efficacy of an in vitro composed bacteriophage cocktail for reduction of Campylobacter in commercial broiler flocks and to develop recommendations for this use of bacteriophages.

The present study used a cocktail of four bacteriophages that was tested in a preliminary test in vivo as being effective. Quantitative testing of samples was carried out 1, 3, 7, 14, 21 and 28 days post phage application. Three days post phage application a significant Campylobacter reduction of 1.7 CFU/g cecal content occurred in the experimental group compared to the control. Afterwards three field trials on commercial broiler farms were performed. Per group nine fecal samples were taken each, before and at certain dates after phage application until slaughter. Nine cecal samples of each group were taken directly from the production line when the animals were slaughtered. All samples were tested quantitatively for Campylobacter and bacteriophages. Significant reduction of Campylobacter occurred in two field trials: In one field trial Campylobacter was reduced under the detection limit (50 cfu/g feces, P= 0.014) one day after phage application. In another field trial the control group became cross contaminated by phages, followed by a significant drop in Campylobacter counts (P= 0.002). Bacteriophages were detected in samples of the experimental groups of all field trials and in the control group of the third field trial. During the trials, approximately 100 Campylobacter isolates were obtained from each group and sampling in all field trials. Isolates of all groups were tested for their biotype. In two experimental groups of the trials, proportions of the biotypes shifted after phage application in favour of one biotype (biotype 1 in field trial 2; biotype 2 in field trial 3). For further examination of the colonization process, all 668 isolates from the third field trial were tested for phage susceptibility, motility and Gamma Glutamyl Transferase (GGT) activity. Motility and GGT activity are important for in vivo colonization. In the present study, they correlated with phage susceptibility. Susceptible Isolates were more motile and exhibited GGT activity more often. They were more often isolated in presence of phages than the non susceptible isolates. Results suggest that they out-competed nonsusceptible isolates due to increased colonization ability. MLST, MALDI-TOF and biochemical analyses were carried out but clustering of phylogenetic comperisons did not agree.

Hence, in the present study first field trials under commercial conditions were carried out for phage application targeting Campylobacter. Results show that bacteriophages can reduce Campylobacter in commercial broiler flocks significantly. However, further investigations and developments of the method are necessary in order to achieve reproducible results under field conditions. From results of these trials recommendations were generated that intend to achieve this aim. Furthermore the population dynamics of Campylobacter in one field trial were investigated. Phage resistant isolates showed reduced colonization. Tests revealed two colonization factors that were reduced in these isolates: Motility and GGT activity. A better understanding of the interaction between phages, bacteria and colonization of bacteria in their host organism is necessary in order to use phages effectively and enduring for reducing Campylobacter in primary production.

keywords

Campylobacter, Bakteriophagen, Phagentherapie, bacteriphage, phagetherapy 

kb

793